Terumi Mukai e o enigma das taxas de mutação deletérias

Genetics , Volume 153, Edição 2, 1º de outubro de 1999, Páginas 515–523,

https://doi.org/10.1093/genetics/153.2.515Publicados:01 de outubro de 1999

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DURANTE as décadas de 1960 e 1970, Terumi Mukai e seus colegas conduziram alguns experimentos que tiveram um grande impacto na genética populacional e evolutiva. Sua busca era estimar a taxa genômica e os efeitos de mutações deletérias. No entanto, reavaliações recentes de seu trabalho levaram a dúvidas sobre a validade de algumas de suas conclusões. Além disso, um interesse renovado no problema das mutações deletérias, originado em parte dessas dúvidas e em parte de um interesse no problema perene da evolução do sexo, levou a uma série de novos experimentos.

A maioria dos biólogos concordaria que a maioria das mutações que alteram sequências de proteínas ou alteram a expressão gênica são prejudiciais, porque perturbam sistemas bioquímicos e fisiológicos altamente adaptados. Mutações que geram fenótipos “visíveis” geralmente são manifestamente deletérias, mas a natureza deletéria da maioria das alterações de aminoácidos também pode ser inferida a partir do alto grau de conservação das sequências codificadoras de proteínas em relação ao DNA não codificante. Mutações deletérias impõem uma “carga” (redução seletiva na aptidão) nas populações; os indivíduos morrem ou não se reproduzem, porque carregam mutações prejudiciais, um processo que MULLER ( 1950 ) denominou “morte genética”. HALDANE ( 1937 ) mostraram que a carga imposta por uma mutação deletéria era independente de seu efeito seletivo. Isso ficou conhecido como o princípio Haldane-Muller e implica que a carga mutacional depende em grande parte da taxa na qual as mutações deletérias ocorrem em todo o genoma, U. Haldane aplicou este princípio para estimar a carga mutacional em Drosophila melanogaster assumindo que a mutação a taxa de mutações deletérias não letais foi duas vezes maior que a de letais, para as quais uma estimativa estava disponível na época. Ele concluiu que as populações experimentariam uma depressão de aproximadamente 4% na aptidão através da eliminação de mutações deletérias, uma “perda de aptidão”, ele sugeriu, que era “o preço pago por uma espécie por sua capacidade de evolução posterior” ( HALDANE 1937 , página 349).

Em princípio, a estimativa de U requer uma maneira imparcial de medir a taxa de mutação em uma amostra aleatória dos genes no genoma. O primeiro trabalho detalhado foi realizado por MULLER ( 1928 ) em D. melanogaster para estimar taxas de mutações que são letais quando homozigotas. CROW e TEMIN ( 1964 ) revisaram um grande conjunto de trabalhos sobre taxas de mutação letal recessiva; as taxas médias são 0,0026 e 0,0046 por geração para o cromossomo X e segundo, respectivamente, e implicam uma taxa letal de ~0,01 para o genoma haplóide. No entanto, muitas mutações deletérias provavelmente não são letais, e a taxa de não letais pode ser consideravelmente maior.

Uma abordagem para estimar a taxa de mutação para mutações deletérias, mas não letais, é usar informações sobre a taxa na qual surgem mutações visíveis. Para loci que geram mutações visíveis em Drosophila, as taxas normalmente giram em torno de ^10-5 ( DRAKE et al. 1998 ). Assumindo que D. melanogaster contém 15.000 loci, isso se traduz em uma taxa de mutação em todo o genoma de 0,15 por haplóide, cerca de 15 vezes maior que a taxa letal. Paradoxalmente, no entanto, mutações com efeitos visíveis ocorrem com muito menos frequência do que letais em pesquisas de todo o genoma ( MÜLLER 1950 ). A explicação provável é que os genes usados em ensaios para fenótipos visíveis têm taxas de mutação mais altas do que as de outros genes, por várias razões. Além disso, muitas mutações deletérias não têm efeitos visíveis. Precisamos de um método que forneça uma estimativa imparcial e ampla do genoma da taxa de mutação para todas as mutações deletérias.

Medindo taxas e efeitos de mutações de viabilidade em Drosophila: A ideia de um experimento de acumulação de mutações (MA) pode ser rastreada até MULLER ( 1928 , p. 288): “se um determinado lote de indivíduos, conhecido por não conter genes mutantes no start, é criado através de uma série de n gerações (ou seja, para “F _n ”), e um dos indivíduos desta última (nésima) geração é então testado para genes mutantes…, este teste revelará todos os genes mutantes que surgiram em qualquer uma das n gerações anteriores”. MULLER ( 1928 ) também sugeriu o uso do sistema balanceador de cromossomos curly (Cy) para tornar mais viável o acúmulo de mutações em larga escala (ver CROW e ABRAHAMSON 1997 para Perspectivas recentes). O primeiro experimento para medir os efeitos de aptidão de um acúmulo cromossômico de mutações espontâneas foi realizado mais de 30 anos depois por Mukai, trabalhando com linhagens de Drosophila no Instituto Nacional de Genética, Mishima, Japão ( MUKAI 1964 ). O projeto de Mukai fez uso do sistema de cromossomos balanceador Cy/Pm para manter um segundo cromossomo do tipo selvagem protegido da seleção no estado heterozigoto por várias dezenas de gerações. O cromossomo do tipo selvagem (+) foi replicado, de modo que o acúmulo aleatório de mutações espontâneas leva à divergência entre as linhas cromossômicas para um fenótipo mensurável e, se os efeitos mutacionais forem direcionais, a uma mudança no fenótipo médio. O fenótipo medido por Mukai foi um índice de viabilidade, a fração de homozigotos +/+ em relação a heterozigotos Cy/+ na progênie de cruzamentos entre heterozigotos Cy/+ ( WALLACE 1956 ) (Cy é homozigoto letal). Mukai realizou ensaios com vários frascos em cada linha cromossômica e assim pôde particionar a variância na viabilidade entre e dentro das linhagens em diferentes gerações para obter uma estimativa da taxa de aumento da variância genética por geração, V _m . A observação surpreendente, no entanto, foi que a viabilidade média diminuiu a uma alta taxa de ~0,4% por geração. A taxa de erosão na viabilidade extrapolada para o genoma haplóide foi superior a 1% por geração, excluindo letais e prejudiciais graves.

O principal objetivo de Mukai era obter informações sobre as taxas e efeitos de mutações poligênicas que fundamentam as mudanças na média e variância para viabilidade. Para fazer isso, ele se voltou para as fórmulas de BATEMAN ( 1959 ) que relacionam as mudanças observadas de média e variância com a taxa de mutação em todo o cromossomo, U ₂ , e efeito de mutação deletério médio, s¯, ΔM = U ₂ s¯, eVm=você2s‒2( 1 +C2)Vm=você2s‒2(1+C2)⁠ , onde C é o coeficiente de variação entre os efeitos mutacionais ( CROW e SIMMONS 1983 ). Se C for assumido como zero (isto é, um modelo de efeitos de mutação iguais), uma estimativa para U ₂ é ΔM ² /V _m , e uma estimativa para s¯ é V _m /ΔM. Mukai calculou que era necessário um mínimo de ∼0,14 mutações por geração com efeitos de viabilidade de ≤3% para explicar a mudança de média e variância das segundas linhas cromossômicas.

Mukai posteriormente mudou-se para a Universidade de Wisconsin, onde, encorajado por James Crow, repetiu seus experimentos de 1964 ( MUKAI et al. 1972 ). Distribuições de viabilidade relativa em quatro gerações em um dos três conjuntos de linhagens estudadas são mostradas na Figura 1 .

Houve um acúmulo de cromossomos portadores de letalidade a uma taxa semelhante à do primeiro estudo (~0,006/segundo cromossomo/geração). Cromossomos com viabilidade severamente reduzida (prejudiciais) acumularam-se em uma frequência semelhante à dos letais. Assim como no estudo anterior de Mukai, o resultado mais impressionante foi a queda na viabilidade relativa dos cromossomos “quasenormais” restantes, a uma taxa de cerca de 1% por geração, quando extrapolados para todo o genoma. Também em Wisconsin, Ohmi Ohnishi, como parte de um estudo dos efeitos do mutagênico químico etil metanossulfonato (EMS), investigou os efeitos de viabilidade de mutações espontâneas em um projeto semelhante ao de Mukai. Os resultados foram qualitativamente semelhantes aos dois estudos anteriores, embora a taxa de decaimento mutacional dos cromossomos quase normais tenha sido um pouco menor ( OHNISHI 1977 ). Um resumo dos resultados desses três estudos, juntamente com uma série de experimentos posteriores, é apresentado na Tabela 1 .

TABELA 1

Estimativas de taxas e efeitos de mutações deletérias (por genoma haploide)

Espécies	Método	Referência	você	(SE) [IC 95%]	s¯	(SE)
D. melanogaster	MA (viabilidade competitiva)	MUKAI ( 1964 )	0,35		0,027
		MUKAI et ai. ( 1972 )	0,47		0,023
		OHNISHI ( 1977 )	0,14		0,030
	MA (viabilidade não competitiva)	GARCIA – DORADO et al. ( 1999 )	0,02		0,10
	MA (viabilidade competitiva)	FRITE et ai. ( 1999 )	0,052	(0,017)	0,11	(0,02)
	Band-morph ^a	HARADA et ai. ( 1993 )	0,050	[0,014-0,13]
	Divergência molecular ^b	Este artigo	0,028	(0,002)
E. coli	MA (fitness)	KIBOTA e LYNCH ( 1996 )	0,00017		0,012
	^C molecular	Este artigo	0,0016
C. elegans	MA (taxa de crescimento intrínseca)	KEIGHTLEY e CABALLERO ( 1997 )	0,0035	(0,001)	0,10	(0,01)
		VASSILIEVA e LYNCH ( 1999 )	0,0080	(0,014)	0,21	(0,18)
H. sapiens	Band-morph ^d	NEEL et ai. ( 1988 )	0,4	[0,09-3,4]
	Divergência molecular ^e	EYRE – WALKER e KEIGHTLEY ( 1999 )	0,8	(0,4)

As estimativas dos experimentos de MA são todas baseadas em modelos de efeitos iguais. Erros padrão aproximados dos limites de confiança são fornecidos, quando disponíveis.

^uma

Taxa de mutação de alteração de aminoácidos em banda morfológica em sequências de codificação de proteínas.

Taxa de mutação de alteração de aminoácidos baseada na divergência entre os grupos melanogaster e obscura.

Assume uma estimativa independente para a taxa de mutação de nucleotídeos (ver texto).

Taxa de mutação de alteração de aminoácido em band-morph em sequências de codificação de proteínas, assumindo que 38% das mutações de aminoácidos são deletérias (ver texto).

Taxa de mutação de alteração de aminoácidos com base na divergência entre humanos e chimpanzés.

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Tomados em conjunto, os experimentos de Mukai e Ohnishi implicam que a maioria das moscas individuais conterá uma nova mutação levemente deletéria com um efeito da ordem de alguns por cento, mas a taxa de mutação poderia ser muito maior e o efeito de mutação médio menor se os efeitos da mutação variassem . Os resultados de Mukai e Ohnishi sobre a taxa de mutação deletéria genômica em Drosophila foram os únicos dados disponíveis nos últimos 20 anos, foram altamente influentes na genética evolutiva e figuram frequentemente como parâmetros em modelos genéticos populacionais (ver, por exemplo, CHARLESWORTH e CHARLESWORTH 1998 ).

FIGURA 1.

—Distribuições de médias de linha para viabilidade relativa em Drosophila melanogaster em quatro gerações (t) de acúmulo de mutação, replotadas de Mukai et al. (1972) (linhas CH).

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—Distribuições de médias de linha para viabilidade relativa em Drosophila melanogaster em quatro gerações (t) de acúmulo de mutação, replotadas de MUKAI et al. ( 1972 ) (linhas CH).

Taxas de mutação em genes codificadores de proteínas de Drosophila: o experimento de Mukai em 1977 sobre taxas de mutação espontânea em loci enzimáticos em Drosophila, realizado na Universidade Estadual da Carolina do Norte, apresentou claramente um desafio aos resultados anteriores sobre taxas de mutação poligênica para viabilidade ( MUKAI e COCKERHAM 1977 ). O experimento envolveu a manutenção de 1000 Cy/+ segunda linha cromossômica por 175 gerações, seguido por uma busca por novas variantes eletroforéticas (band-morph) em cinco loci enzimáticos localizados no cromossomo 2. Como muitos dos experimentos de Mukai, este experimento foi realizado em grande escala. Após mais de 1,6 milhão de gerações de alelos, no total, três novas variantes foram detectadas, dando uma taxa de mutação de morfologia de banda de 1,8 × 10 ^-6. Assumindo 6.000 genes do cromossomo 2, a taxa de mutação cromossômica para alterações de aminoácidos é, portanto, 0,032. No entanto, um estudo de acompanhamento das mesmas linhas após 36-49 gerações adicionais com dois loci adicionais (>3,1 milhões de gerações de alelos) não revelou novas mutações bandmorph ( VOELKER et al. 1980 ). Um estudo posterior de HARADA et al. ( 1993 ) com um conjunto diferente de linhas e sete loci enzimáticos (~1,7 milhões de gerações de alelos) também não revelaram mutações de morfologia de banda. A estimativa da taxa de mutação bandmorph agrupada para as duas pesquisas juntas é de 7,5 × 10 ^-7 (limite de confiança superior de 95% de 1,9 × 10 ^-6 ; HARADA et al. 1993 ). A taxa de mutação de aminoácidos do cromossomo 2 inferida é, portanto, 0,013 (limite superior 0,034). Esta é uma subestimativa porque os genes pesquisados por Mukai e colegas são bastante mais curtos do que os genes de Drosophila em geral: ∼400 códons nos estudos de banda-morfo contra uma média de ∼600 códons. Uma estimativa revisada para o cromossomo 2 é, portanto, 0,020 (0,051), e isso se traduz em uma taxa genômica haploide de 0,05, um valor muito abaixo das estimativas mínimas de taxas de mutação para poligenes de viabilidade ( Tabela 1 ). A taxa de mutação nula foi 17 vezes maior do que a taxa de mutação bandmorph, mas é provável que isso tenha ocorrido por causa da disgenesia híbrida. A mobilização do elemento hobo ocorreu nas linhas iniciadas por Mukai e Cockerham ( YAMAGUCHI e MUKAI 1974 ; HARADA et ai. 1990 ). No outro conjunto de linhas, HARADA et al. ( 1993 ) descobriram que cinco dos seis alelos nulos analisados estavam associados à inserção de um elemento P próximo a um sítio de iniciação da transcrição. Podemos supor que a mobilização do elemento transponível (TE) não teria inflado as taxas de mutação band-morph.

Os estudos de band-morph podem ser conciliados com altas taxas de mutações fenotipicamente detectáveis? Existem várias razões possíveis para a discrepância entre os estudos MA e banda-morfo. Com base em sua estimativa para a taxa de mutação banda-morfo, MUKAI e COCKERHAM ( 1977 ) concluíram que a maioria das mutações de viabilidade observadas nos estudos anteriores deve ter ocorrido fora das sequências de codificação. O alvo no DNA não codificante é suficientemente grande? Cerca de 60% do genoma de Drosophila melanogaster é de cópia única, e aproximadamente 25% disso é codificação de proteínas; ou seja, o genoma da Drosophila tem 1,8 × 10 ⁸ bp de comprimento e contém aproximadamente 15.000 genes ( SIMMEN et al. 1998 ), que têm em média 1800 pb de comprimento (EN MORIYAMA , comunicação pessoal). Vamos supor que todas as mutações que alteram a morfologia da banda sejam deletérias e que as mutações deletérias sejam tão comuns no DNA não codificante de cópia única quanto no DNA codificante. Sob essas suposições generosas, a taxa de mutação deletéria genômica seria de 0,2, um valor que é quase consistente com as estimativas de taxa de mutação deletéria mínima de experimentos de MA ( Tabela 1 ). Mas assumimos que o DNA não-codificante de cópia única está sob o mesmo nível de restrição que os sítios não-sinônimos, e sabemos que isso não é verdade: sequências flanqueadoras 5′, íntrons e sítios sinônimos evoluem muito mais rápido do que sítios não-sinônimos em Drosophila. KREITMAN e HUDSON 1991 ; LI 1997 ), indicando que a proporção de mutações “silenciosas” removidas pela seleção natural é muito menor do que a proporção de mutações que alteram aminoácidos. Essas considerações tornam implausível que mutações pontuais em uma taxa inferida a partir dos estudos de taxa de mutação banda-morfo possam explicar as estimativas mínimas para mutações de viabilidade. Pequenas mutações de inserção-deleção não ocorrem em uma taxa suficientemente alta para compensar o déficit ( PETROV et al. 1998 ; RAMOS – ONSINS e AGUADE 1998 ).

Um papel para elementos transponíveis? Os TEs podem explicar a discrepância entre a estimativa de U dos experimentos de MA e os estudos de morfologia de banda, uma vez que é improvável que TEs gerem alterações de morfologia de banda que não sejam nulas, enquanto podem gerar mutações deletérias. Para fazer isso, os TEs precisam ocorrer em frequências apreciáveis e causar efeitos de poucos por cento.

No caso das segundas linhagens cromossômicas investigadas por MUKAI et al. ( 1972 ), a análise citogenética descartou a possibilidade de que a disgenesia híbrida de PM tenha ocorrido ( YAMAGUCHI e MUKAI 1974 ). No entanto, existem muitos outros tipos de elementos transponíveis em Drosophila, e as evidências de que cruzamentos envolvendo balanceadores muitas vezes levam à mobilização de várias famílias TE se acumularam na última década ( PASYUKOVA et al. 1988 ; GARCIA GUERREIRO e BIEMONT 1995 ; KOZHEMIAKINA e FURMAN 1995 ). As famílias de elementos para as quais o movimento é aumentado geralmente são relacionadas à cópia ou à cópia. O fenômeno pode não estar relacionado ao balanceador em si, mas parece estar relacionado ao cruzamento, é dependente da linhagem e persiste por muitas gerações ( GEORGIEV et al. 1990 ).

Os TEs causam efeitos suficientemente grandes? EANES et ai. ( 1988 ) realizaram um experimento para medir os efeitos de aptidão hemizigótica da inserção do elemento P, sem excisão subsequente, no cromossomo X de Drosophila macho. Sua estimativa para o efeito hemizigótico médio de uma inserção de elemento P foi de 0,014 (±0,006 SE). Conforme observado por Eanes et al., isto está próximo das estimativas para efeitos de viabilidade de mutações espontâneas ( Tabela 1 ). Uma segunda linha de evidência sugerindo que os TEs podem gerar mutações levemente prejudiciais vem do trabalho em Escherichia coli. A distribuição de fitnesses de linhas carregando inserções Tn10 simples e independentes ( ELENA et al. 1998 ) é notavelmente semelhante à distribuição de viabilidade nos estudos do balanceador de Drosophila ( Figura 1 ). O efeito de fitness médio de uma inserção de Tn10 foi estimado em ~3%.

CROW e SIMMONS ( 1983 ) também notaram que em híbridos disgênicos, uma forma de impulso meiótico pode levar a uma frequência aumentada de recuperação do cromossomo balanceador em relação ao tipo selvagem ( KIDWELL et al. 1977 ). Como a viabilidade é medida como números relativos de tipos selvagens para balanceadores, isso pode ser importante se a força do impulso meiótico aumentar com o tempo. Não há evidência direta de que tal fenômeno tenha ocorrido em experimentos de MA.

Argumentos sobre os controles: Tem sido sugerido que parte do aparente declínio na aptidão das linhas quasenormais nos experimentos de Mukai e Ohnishi pode ser de origem não mutacional ( KEIGHTLEY 1996 ; GARCIA – DORADO 1997 ). Duas observações motivaram essa sugestão. Primeiro, houve uma diminuição relativamente grande na aptidão das linhas quase normais sem um aumento correspondente na variância. Análises estatísticas sugeriram que isso era inconsistente com um modelo no qual os efeitos de novas mutações vêm de uma distribuição contínua (gama), a menos que um efeito não mutacional seja incluído no modelo. Em segundo lugar, o declínio na viabilidade das linhas quasenormais em um experimento de mutagênese EMS de Ohnishi, e em um experimento MA espontâneo mais recente ( FERNANDEZ e LOPEZ – FANJUL 1996 ), não foi tão dramático quanto nos experimentos de MA de Mukai e Ohnishi. A explicação não mutacional mais plausível para os resultados de Mukai e Ohnishi vem de um experimento posterior de Drosophila MA envolvendo Cy/Pm. FRITE et ai. ( 1999 ) observaram que a expressão de Cy é variável, e os heterozigotos podem ser distinguidos dos tipos selvagens apenas se um marcador adicional do cromossomo 2 estiver presente. Se a capacidade de um experimentalista de reconhecer a expressão fraca de Cy melhorasse ao longo do tempo, a viabilidade relativa dos cromossomos do tipo selvagem pareceria diminuir ao longo do tempo.

No entanto, há alguma evidência de que o declínio na aptidão das linhas MA analisadas por Mukai é genuíno. MUKAI ( 1964 ) e MUKAI et al. ( 1972 ) utilizaram um “método de ordem” para obter valores de viabilidade de controle. Linhas de alta viabilidade na geração t ₂ foram usadas para selecionar linhas na geração t ₁ para uso como controle, este último assumido como livre de novas mutações. Embora o cálculo de Mukai em seu artigo de 1964 para a última geração fosse provavelmente inadequado ( KEIGHTLEY 1996 ), os dados restantes implicam valores semelhantes aos originalmente inferidos (JD FRY , comunicação pessoal).

Como, então, poderia haver uma grande diminuição na viabilidade média das linhas de Mukai, mas não um grande aumento na variância? É possível que a distribuição dos efeitos da mutação seja multimodal ( KEIGHTLEY 1996 ); além de uma classe de mutações com efeitos bastante grandes, pode haver uma classe muito maior de mutações com efeitos muito pequenos. As mutações com pequenos efeitos podem levar a uma diminuição na viabilidade média sem um grande aumento na variância. TEs podem estar implicados em tal declínio (veja acima) e, portanto, podem explicar a distribuição qualitativamente diferente de médias de linha para viabilidade observada por Ohnishi em seu estudo EMS (EMS gera principalmente mutações pontuais).

Experimentos recentes de acumulação de mutações: Recentemente, houve um interesse renovado em inferir taxas e efeitos de mutações deletérias, e revisamos brevemente os experimentos publicados abaixo.

Drosophila melanogaster: O experimento MA publicado há mais tempo em um eucarioto foi relatado por FERNANDEZ e LOPEZ – FANJUL ( 1996 ). A partir de uma linhagem isogênica marcada, 200 linhagens foram mantidas por acasalamentos irmão-irmã por mais de 100 gerações. Embora a seleção contra mutações deletérias atue com maior eficiência em linhagens de irmãos completos do que em linhagens balanceadoras cromossômicas, mutações levemente deletérias devem se fixar aleatoriamente em linhagens de irmãos completos, pelo menos durante a fase inicial do experimento, quando a fertilidade e a viabilidade são relativamente altas. No entanto, espera-se que mutações fortemente deletérias sejam eliminadas seletivamente. Como controle, foi mantida uma população de grande tamanho efetivo da mesma cepa, com a ideia de que mutações deletérias seriam eliminadas pela seleção natural atuando com maior eficiência em uma grande população. A viabilidade média de ovo a adulto (medida sob condições não competitivas) diminuiu em relação ao controle a uma taxa de apenas cerca de 0.GARCIA – DORADO 1997 ). As estimativas de Bateman de U (por genoma haplóide) e s são ∼0,02 e ∼0,10, respectivamente ( GARCIA – DORADO et al. 1999 ). A estimativa para U é, portanto, mais de 10 vezes menor do que as obtidas por Mukai e Ohnishi ( Tabela 1 ).

FRITE et ai. ( 1999 ) relataram os resultados de um experimento de cromossomo 2 MA em Drosophila realizado ao longo de 27-33 gerações com um design semelhante ao de Mukai e Ohnishi, mas, além disso, realizaram ensaios paralelos de três populações de controle mantidas em grande tamanho efetivo. A viabilidade dos homozigotos do segundo cromossomo (em relação aos heterozigotos Cy) diminuiu a uma taxa intermediária à observada por Mukai e Ohnishi. No entanto, a variação genética para a viabilidade aumentou três a cinco vezes mais rápido, e a taxa de mutações letais foi duas vezes maior. As estimativas de Bateman resultantes de U (extrapoladas para todo o genoma haplóide) e s¯ são 0,05 e 0,11, respectivamente.

Os controles nesses experimentos não são totalmente satisfatórios, pois não excluem a possibilidade de adaptação ao ambiente laboratorial pela fixação de mutações benéficas ou um declínio na aptidão média por acúmulo de mutações deletérias que permanecerão em baixa frequência, embora Fry et al. não observaram mudanças significativas na viabilidade das populações controle ou na variância genética da população controle. É notável que elementos de cópia ativamente transpostos estavam presentes nas falas de Fry et al. (SV NUZHDIN , comunicação pessoal).

Um desenho diferente do experimento MA em Drosophila (“vizinhança de classe média”) empregando linhagens alheias forneceu estimativas para a taxa de perda de aptidão da acumulação de mutações ( SHABALINA et al. 1997 ), embora tenha havido debate sobre se as mudanças na aptidão podem ser totalmente atribuída a mutação ( KEIGHTLEY et al. 1998 ; LYNCH et al. 1999b ).

Um experimento de MA em uma espécie diferente de artrópode, Daphnia pulex, foi relatado por LYNCH et al. ( 1999a ), mas foram encontrados problemas com baixa aptidão de uma população de controle congelada.

E. coli: KIBOTA e LYNCH ( 1996 ) realizaram um experimento de MA em que 50 linhagens foram testadas para aptidão contemporaneamente com uma população ancestral criopreservada, então possíveis problemas relacionados com um controle em evolução não deveriam ocorrer. As células cresceram exponencialmente por ~25 rodadas de divisão celular entre gargalos de uma célula por linha. Em simulações, Kibota e Lynch mostraram que a maioria das mutações com efeitos superiores a 6% seriam seletivamente perdidas durante a fase de crescimento exponencial, enquanto mutações com efeitos próximos de 1% ou menos se comportariam como seletivamente neutras e seriam retidas. A aptidão média das linhagens diminuiu linearmente em ~2% em ~7500 gerações, e a variância entre linhas também aumentou linearmente. Com BATEMAN‘s ( 1959 ), o limite inferior para U foi 0,00017 e o limite superior para s¯ foi 0,012.

Esta estimativa MA para U pode ser comparada com uma estimativa molecular baseada na taxa de mutação espontânea por nucleotídeo. Medindo as taxas de mutação sem sentido para auxotróficos de lacI ou histidina, DRAKE ( 1991 ) estimou que a taxa de mutação espontânea por par de bases em E. coli é ~6 × ^10-10 , um valor consistente com estimativas de experimentos de reversão ( HALL 1991 ). O genoma de E. coli K12 tem 4,6 × 10 ⁶ pb, dos quais 87,8% são codificadores de proteínas, 0,8% codificam RNA e o restante DNA não codificante ou repetitivo ( BLATTNER et al. 1997 ). As divergências relativas de sítios sinônimos e não sinônimos entre coliformes relacionados implicam que >95% das mutações que alteram aminoácidos são deletérias sob condições naturais (A. EYRE – WALKER , resultados não publicados). A fração de nucleotídeos que altera um aminoácido se mutado é ~0,7, então uma estimativa de U em E. coli é (6 × 10 ^-10 ) × (4,6 × 10 ⁶ ) × 0,878 × 0,95 × 0,7 = 0,0016. A estimativa MA é, portanto, cerca de 10 vezes menor do que a estimativa molecular, presumivelmente devido à variabilidade entre os efeitos de novas mutações. Mutações deletérias em DNA não codificante e mutações de deleção de inserção não são incluídas na estimativa molecular.

Caenorhabditis elegans: Em dois experimentos MA realizados ao longo de 60 gerações ( KEIGHTLEY e CABALLERO 1997 , KC97) e 50 gerações ( VASSILIEVA e LYNCH 1999 , VL99), vermes hermafroditas individuais da cepa N2 de tipo selvagem foram transferidos em sublinhas replicadas a cada geração, e populações ancestrais congeladas foram usadas como controles. Os resultados dos dois experimentos são qualitativamente semelhantes. Por exemplo, no caso da taxa de crescimento intrínseca (r), as estimativas para U são 0,008 (VL99) e 0,003 (KC97) e para s são 0,21 (VL99) e 0,10 (KC97). Para r, as estimativas de Bateman são semelhantes às estimativas de máxima verossimilhança (ML), se forem assumidos efeitos mutacionais iguais. Para outros traços de história de vida, as estimativas de Bateman e ML são mais divergentes, mas as estimativas de ML concordam razoavelmente bem entre os experimentos e também têm erros padrão menores, com estimativas médias entre os traços de história de vida para U de ~0,005 em ambos os experimentos (P. KEIGHTLEY e T.BATAILLON , resultados não publicados). As estimativas de U(s) são uma a duas ordens de magnitude mais baixas (uma ordem de magnitude mais alta) do que as estimativas correspondentes de Mukai e Ohnishi para Drosophila. Apenas uma pequena parte da diferença entre as taxas pode ser explicada pela diferença no número de divisões celulares por geração, cerca de três vezes menor em C. elegans do que em Drosophila. No entanto, a diferença mais marcante entre os experimentos de Drosophila e C. elegans MA é a queda muito menor na média das linhas quasenormais de C. elegans em um número comparável de gerações, enquanto o número de linhas prejudiciais foi semelhante (compare as Figuras 1 e 2 ). Essa diferença entre os experimentos de Caenorhabditis e Drosophila não pode ser explicada pela seleção natural, que opera com maior eficiência em linhagens de autofecundação do que em linhagens balanceadoras de cromossomos, pois a seleção remove uma fração maior de mutações fortemente deletérias do que de mutações levemente deletérias. Mudanças de média e variância em C. elegans foram, portanto, dominadas por linhagens contendo mutações com efeitos fortemente deletérios, daí as estimativas de s maiores, enquanto mutações com efeitos pequenos tiveram um impacto muito menor. A cepa C. elegans N2 não tem atividade TE significativa ( EIDE e ANDERSON 1985 ), e isso poderia explicar a diferença qualitativa no comportamento entre as linhas MA de Drosophila e C. elegans.

Limitações dos experimentos de acumulação de mutações e abordagens moleculares: Embora os experimentos de MA tenham produzido informações importantes sobre a taxa e a natureza das mutações deletérias, sua principal desvantagem é que eles nos fornecem pouca ou nenhuma informação sobre mutações com efeitos muito pequenos. No entanto, as mutações de pequeno efeito são frequentemente tão importantes quanto as mutações de grande efeito na evolução; por exemplo, a carga de mutação exercida por uma mutação é independente da força da seleção sob seleção multiplicativa, e mutações fracamente selecionadas podem realmente ter maiores efeitos na variação genética através da seleção de fundo do que mutações fortemente selecionadas ( NORDBORG et al. 1996 ). Mutações de pequeno efeito podem passar despercebidas em um experimento de MA porque os ensaios de aptidão em experimentos de laboratório são brutos. Enquanto a seleção natural influencia o destino de qualquer mutação com um efeito maior que 1/N _e , os melhores experimentos com quimiostatos podem detectar diferenças de aptidão de apenas 0,5% ( DYKHUIZEN 1990 ). Uma vez que a maioria dos organismos provavelmente tem tamanhos populacionais efetivos maiores que 10.000 ( NEI e GRAUR 1984 ), a maioria das mutações deletérias pode ser perdida em um experimento de MA.

FIGURA 2.

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—Distribuições de médias de linha para a taxa de crescimento intrínseca r (dia ^-1 ) em dois experimentos MA de C. elegans. (a) Calculado a partir de dados sobre reprodução específica por idade de KEIGHTLEY e CABALLERO ( 1997 ) pelos métodos de CHARLESWORTH ( 1994 ). A medida r é a média para linhas com quatro placas replicadas, cada uma contendo um par de vermes. (b) Reproduzido de VASSILIEVA e LYNCH ( 1999 ). A medida r é a média para linhas com cinco placas replicadas, cada uma contendo um verme; isso gera mais variação do que uma medida baseada em pares de vermes.

Uma abordagem alternativa para estimar U é usar dados de sequência de DNA. O método geral está implícito na teoria neutra da evolução molecular, proposta há cerca de 30 anos. Sob a teoria neutra, as mutações são neutras, ou seja, não têm efeitos de aptidão, ou são deletérias. O DNA neutro evolui a uma taxa u, a taxa de mutação do nucleotídeo, enquanto o DNA sob seleção evolui a uma taxa uf, onde f é a proporção de mutações que são neutras, então 1 – f é a proporção que é deletéria. Uma estimativa da proporção de mutações que são deletérias em uma seção de DNA pode, portanto, ser obtida comparando-se a taxa de evolução em alguma sequência com a de uma sequência completamente neutra. Esta é uma subestimativa se houver mutações vantajosas.KONDRASHOV e CROW 1993 ). Eles mapearam um esquema para estimar U sequenciando seções ortólogas aleatórias do genoma em duas espécies intimamente relacionadas. Ao comparar as taxas de evolução desses clones aleatórios com a encontrada em uma sequência neutra, eles propuseram que seria possível estimar a proporção média de mutações deletérias em todo o genoma e, portanto, U. Na época, os dados necessários para esta abordagem não estavam disponíveis. No entanto, SHABALINA e KONDRASHOV ( 1999 ) conseguiram realizar parte do cálculo recentemente com C. elegans e seu parente C. briggsae. Eles alinharam seções aleatórias do genoma de C. briggsae ao genoma de C. elegans; onde encontraram um alinhamento acima do esperado em uma sequência aleatória de DNA, eles inferiram restrição. Eles estimaram que cerca de 17% dos nucleotídeos em íntrons e regiões intergênicas estavam sob restrição em comparação com 72% dos nucleotídeos em éxons. Os resultados implicam que cerca de um terço de todas as mutações no genoma de Caenorhabditis são deletérias. Infelizmente, não há estimativas confiáveis da taxa de mutação por nucleotídeo em Caenorhabditis, então eles não puderam estimar U.

Uma simplificação da ideia de Kondrashov e Crow é estimar U apenas para sequências codificadoras de proteínas, assumindo que mutações sinônimas são neutras; a taxa de substituição sinônima (Ks ₎ é, portanto, uma estimativa da taxa de mutação de nucleotídeo. A proporção de mutações de mudança de aminoácidos que são deletérias pode ser estimada a partir da razão entre a taxa de substituição não-sinônima (Ka ) e _a de sinônimos; isto é, 1 – K _a /Ks ₌ 1 – f. Assim, uma fórmula simples, K _s (1 – K _a /K _s), produz uma estimativa da taxa de mutação deletéria por sítio de nucleotídeo ao longo do período de tempo em que a taxa de substituição é estimada (geralmente o tempo de divergência da espécie considerada). Isso pode ser convertido em uma estimativa genômica, por geração, se o comprimento e o número de genes no genoma forem conhecidos e as estimativas estiverem disponíveis para o tempo de geração e o tempo de divergência. Recentemente, realizamos esse cálculo para humanos e estimamos que, em média, houve 2,1 mutações de mudança de aminoácidos a cada geração no genoma haplóide desde a separação dos chimpanzés e que 0,8 delas foram deletérias ( EYRE – WALKER e KEIGHTLEY 1999 ). É provável que sejam subestimadas por várias razões, principalmente porque as mutações deletérias que ocorrem fora das sequências codificadoras de proteínas não são incluídas. A abordagem da sequência de DNA para estimar U não é isenta de problemas. Se uma estimativa independente da taxa de mutação de nucleotídeos não estiver disponível, como geralmente é o caso, devemos estimar a taxa de mutação de nucleotídeos a partir de dados de sequência de DNA, e isso significa que precisamos de uma estimativa do tempo de geração e do tempo de divergência de a espécie considerada. Além disso, muitos tempos de divergência foram estimados a partir de dados de sequência de DNA e do relógio molecular, então existe o perigo de circularidade.

Em humanos, uma estimativa independente de U pode ser obtida a partir de estudos para avaliar o efeito da exposição à radiação das explosões das bombas atômicas de Hiroshima e Nagasaki nas taxas de mutação pontual ( NEEL et al. 1988 ). Em crianças de uma coorte não exposta (controle), três mutações de morfologia de banda foram detectadas em ~470.000 testes de alelos, dando uma taxa de mutação de morfologia de banda de 6,4 × 10 ^-6 (intervalo de confiança de 95% 1,3 × 10 ^-6 a 19 × 10 ^-6). Cerca de um terço das mutações de aminoácidos alteram a mobilidade, o que implica uma taxa de mutação de aminoácidos haploides de 1,1. Isso é bastante próximo do valor obtido a partir de dados de sequência de DNA. No estudo da sequência de DNA, estimamos que a proporção de mutações de aminoácidos que eram deletérias e removidas pela seleção natural era de apenas 38% em humanos, de modo que a estimativa baseada em eletromorfos para U é de 0,4.

Como uma estimativa baseada na sequência de DNA de U em Drosophila se compara com os valores obtidos em experimentos de MA e morfologia de banda? A aplicação do método de sequência de DNA a Drosophila é complicada pela seleção na tendência de códons sinônimos ( AKASHI et al. 1998 ), uma vez que a seleção pode diminuir a taxa de substituição de sinônimos e, portanto, levar a uma subestimativa da taxa de mutação de nucleotídeos. LI ( 1997 ) lista as taxas de substituição para 32 genes de Drosophila, estimadas a partir da divergência entre os grupos melanogaster e obscura, que se acredita terem se separado há 30 milhões de anos. A taxa média de substituição de sinônimos é de 1,56 × 10 ^-8 /local/ano, e a taxa média de substituição de não sinônimos é de 1,9 × 10 ^-9 . Se assumirmos que o genoma da Drosophila contém 15.000 genes de comprimento médio de 1800 pb (EN MORIYAMA , comunicação pessoal) e que a Drosophila sofre 10 gerações por ano, estimamos que a taxa de mutação de aminoácidos para Drosophila é de 0,030 por haplóide por geração, de que 0,028 são deletérios. A estimativa do número de mutações de alteração de aminoácidos é ligeiramente inferior ao valor obtido a partir dos estudos de banda-morfo (0,05 por haplóide). Se estimarmos a taxa de substituição de sinônimos dos 25% de genes com as taxas de substituição de sinônimos mais altas, presumivelmente sob a seleção mais fraca, a discrepância desaparece.

A Tabela 1 resume as estimativas de U, em Drosophila e outros organismos, que foram obtidas desde os experimentos inovadores de Mukai. Em Drosophila, as estimativas variam em mais de uma ordem de magnitude, com as estimativas dadas por Mukai e colegas sendo consideravelmente maiores do que todas as outras estimativas. As estimativas de U fornecidas por Mukai e colegas estão corretas? É possível que sejam, mas pelas razões erradas. Os experimentos realizados por FERNANDEZ e LOPEZ – FANJUL ( 1996 ) e FRY et al. ( 1999 ) sugerem que Mukai e colegas provavelmente superestimaram a taxa de mutação para mutações de efeito moderado (ou seja, as mutações detectadas em um experimento de MA), ou houve atividade excepcional de TE nas linhagens de Mukai. No entanto, as estimativas de band-morph e divergência molecular são subestimadas porque não incluem mutações fora das regiões de codificação ou mutações causadas por TEs. A análise de restrição em regiões não codificantes do genoma de Caenorhabditis sugere que metade das mutações deletérias ocorrem em regiões não codificantes; isso significa que a taxa de mutação deletéria causada por mutações pontuais em Drosophila provavelmente será de ∼0,1. A atividade de TE pode elevar a taxa para níveis que se aproximam dos estimados por Mukai e Ohnishi.

As estimativas originais de U ≥ 0,5 e s ≤ 3% dadas por Mukai foram amplamente citadas e usadas por geneticistas. No entanto, é evidente na Tabela 1 que eles podem ter uma aplicação muito limitada. Para todos, exceto C. elegans, temos estimativas de U para sequências codificadoras de proteínas, e elas variam em várias ordens de magnitude, de E. coli em 0,0016 a humanos em 0,8. A atividade de TE também parece variar consideravelmente entre os táxons, com humanos e nematóides tendo poucas mutações TE em comparação com Drosophila e E. coli ( KAZAZIAN 1999 ; EIDE e ANDERSON 1985 ). A menos que haja uma forte correlação negativa entre a atividade de TE e a taxa de mutação pontual, a atividade de TE gerará uma variação ainda maior na taxa de mutação deletéria.

Muller foi um dos primeiros cientistas a se interessar por mutações deletérias. Seu principal interesse era a carga de mutação em populações humanas, um tópico que tem recebido renovado interesse. CORVO ( 1997 ) argumentou que precisamos estar cientes de que a medicina moderna e o saneamento melhorado podem ter impactos importantes em nosso legado genético. À medida que a seleção natural é relaxada, algumas populações acumularão mutações deletérias, levando a uma maior dependência da medicina, colocando nossa população em risco se a capacidade de sustentar cuidados de saúde e saneamento de alto nível for reduzida. Sabemos que os humanos têm uma alta taxa de mutação deletéria, mas as consequências do relaxamento da seleção natural em populações contemporâneas dependerão da distribuição dos efeitos de aptidão de novas mutações, e atualmente carecemos de informações de um modelo apropriado. Ao assumir a estimativa de Mukai do efeito seletivo médio de mutações deletérias em Drosophila, CROW ( 1997 ) e LYNCHet ai. ( 1999b ) argumentaram que as populações humanas podem sofrer degradação genética significativa dentro de um curto período de tempo. No entanto, se houver variação entre os efeitos seletivos, como parece provável, dadas as estimativas contrastantes de MA e moleculares de U em E. coli, então o efeito seletivo médio é uma superestimativa grosseira, assim como nossa provável degradação genética. Como os humanos e espécies relacionadas evitam os efeitos da carga de mutação em uma escala de tempo evolutiva também é uma questão em aberto.

LITERATURA CITADA

AkashiH,Kliman RM,Eyre-Walker UMA,1998Pressão de mutação, seleção natural e a evolução da composição de bases em Drosophila.Genética103:49–60.

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