Artigo de Revisão | Acesso livreVolume 2011 | Artigo ID 407123 | https://doi.org/10.4061/2011/407123

 

 

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Francesca Marini , ¹ Ettore Luzi , ¹ e Maria Luisa Brandi¹Mostre mais

Editor Acadêmico: Daniel Christophe

Recebido01 de dezembro de 2010

Aceitaram03 de março de 2011

Publicados10 de maio de 2011

Resumo

MicroRNAs (miRNAs) são RNAs não codificantes endógenos que regulam negativamente a expressão gênica ligando-se à região não codificante 3′ dos alvos de RNA mensageiro induzindo sua clivagem ou bloqueando a tradução da proteína. Eles desempenham papéis importantes em vários processos biológicos e metabólicos, incluindo tempo de desenvolvimento, transdução de sinal e manutenção e diferenciação celular. Sua desregulação pode predispor a doenças e câncer. Demonstrou-se que a expressão de miRNA está desregulada em muitos tipos de tumores humanos, incluindo câncer de tireoide, e pode ser responsável pela iniciação e progressão do tumor. Neste artigo, revisamos os dados disponíveis sobre a desregulação de miRNA em diferentes tumores da tireoide e descrevemos o papel putativo do miRNA no desenvolvimento do câncer de tireoide.

1. Introdução

MicroRNAs (miRNAs) são RNAs endógenos não codificantes de fita simples de cerca de 22 nucleotídeos que suprimem a expressão gênica por ligação seletiva à região complementar 3′ não traduzida (3′-UTR) de RNAs mensageiros (mRNAs) através do pareamento de bases. Eles desempenham papéis importantes em vários processos biológicos e metabólicos, como diferenciação celular, proliferação e sobrevivência. Atualmente, os miRNAs são considerados um dos mais importantes reguladores da expressão gênica em nível pós-transcricional, e estima-se que mais de um terço de todos os genes humanos podem ser alvo de miRNAs [ 1 ]. Além disso, os miRNAs são fortemente conservados mesmo entre diferentes espécies, reforçando a hipótese de seus papéis importantes em muitos processos biológicos essenciais.

Estudos recentes também apoiaram o papel dos miRNAs na iniciação e progressão de malignidades humanas. A análise da expressão global de miRNA em pacientes com câncer mostrou diferentes padrões de superexpressão ou downregulation de miRNA em câncer versus tecidos normais [ 2 ] em vários tumores humanos, como neoplasia colorretal [ 3 ], leucemia linfocítica crônica de células B [ 4 , 5 ], B linfoma celular [ 6 ], câncer de pulmão [ 7 ], câncer de mama [ 8 ] e glioblastoma [ 9 , 10]. O envolvimento de miRNAs no câncer humano é provavelmente devido ao fato de que mais de 50% dos genes de miRNAs estão localizados em sítios cromossômicos frágeis ou pontos de quebra comuns ou dentro de regiões de deleção ou amplificação que geralmente são alteradas em tumores humanos [ 11 ]. Suspeita-se que a desregulação da expressão de miRNA seja um importante regulador do desenvolvimento e progressão tumoral em vários tecidos humanos. A superexpressão de miRNAs específicos pode levar à repressão da expressão de genes supressores de tumor e, inversamente, a regulação negativa de miRNAs específicos pode resultar em um aumento da expressão de oncogenes; ambas as situações induzem efeitos malignos subsequentes na proliferação, diferenciação e apoptose celular que levam ao crescimento e progresso do tumor.

Evidências experimentais demonstraram que a maioria dos miRNAs apresenta níveis de expressão mais baixos em tumores em comparação com tecidos normais, independente do tipo celular. A expressão global de miRNA é maior em tecidos normais em comparação com suas contrapartes tumorais ou com linhagens de células cancerígenas. Além disso, tumores pouco diferenciados apresentam menor nível global de expressão de miRNA em comparação com tumores mais diferenciados [ 12 ]. Todos esses dados são consistentes com a hipótese de que uma maior expressão global de miRNA está associada à diferenciação celular. A redução da expressão global de miRNA pode reduzir a diferenciação celular que é a marca registrada de todos os cânceres humanos.

2. Transcrição, Maturação e Mecanismos de Ação do miRNA

Os miRNAs são transcritos como transcritos primários longos, poli-adenilados e capeados (pri-miRNAs) que são clivados, em nível nuclear, em ~60-70 nucleotídeos intermediários em forma de grampo (pré-miRNAs) pela RNase III Drosha nuclear [ 13 ]. Após o processamento nuclear por Drosha, os pré-miRNAs são exportados para o citoplasma pelo receptor de transporte nuclear exportina-5 [ 14 ]. No nível citoplasmático, os pré-miRNAs são processados ​​em ~22 nucleotídeos de miRNA duplex pela RNase III Dicer citoplasmática [ 15 ]. Esses produtos de fita dupla são desenrolados por uma helicase ainda não identificada e incorporados como RNAs de fita simples (fita guia) em um complexo de ribonucleoproteína, conhecido como complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) [ 16 .]. Qual das duas fitas de RNA é incorporada no RISC é determinada pela estabilidade dos pares de bases na extremidade 5′ do duplex; a outra fita é degradada. A fita guia incorporada leva o RISC à sequência complementar na 3′-UTR do mRNA alvo, regulando negativamente a expressão gênica no nível pós-transcricional, visando a região 3′-UTR dos mRNAs. Os nucleotídeos 2-8 (referidos como “semente”) dos miRNAs maduros são evolutivamente conservados e resultam em serem cruciais na determinação da especificidade do alvo. Os miRNAs podem regular negativamente a expressão gênica por dois mecanismos pós-transcricionais distintos: clivagem de mRNA ou repressão traducional. A escolha do mecanismo é determinada apenas pela identidade do alvo de mRNA e pelo grau de complementaridade de miRNA-mRNA:17 , 18 ] (Figura 1 ). No primeiro caso, o miRNA pode atuar como pequenos RNAs interferentes (siRNAs) e cliva alvos de mRNA entre os nucleotídeos emparelhados nas posições 10 e 11 do miRNA [ 19 , 20 ]; após a clivagem do alvo o miRNA permanece intacto e pode orientar o reconhecimento e destruição de outros mRNAs [ 17]. Por outro lado, a complementaridade reduzida entre o miRNA e seu mRNA alvo geralmente cria incompatibilidades e protuberâncias na região central do duplex miRNA-mRNA (nas posições 10-12 da sequência do miRNA maduro) que impedem a clivagem semelhante ao siRNA do mRNA alvo. A repressão traducional mediada por miRNA pode ser regulada tanto no nível de iniciação quanto no nível de pós-iniciação do processo de tradução. No bloco de iniciação, o complexo RISC inibe a tradução, interferindo no reconhecimento eIEF4F-cap e no recrutamento da subunidade ribossômica pequena 40S ou impedindo a montagem da subunidade 60S para formar o complexo ribossômico 80S. No bloqueio pós-inicial, o RISC pode inibir o alongamento do ribossomo, induzindo a queda do ribossomo ou facilitando a proteólise dos polipeptídeos nascentes [ 21 ].

figura 1 Modelo de biogênese de miRNA e mecanismos funcionais 

. Os genes de miRNA são transcritos pela RNA polimerase II (pol II) em transcritos primários (pri-miRNAs) que são clivados pelo complexo Drosha-DGCR8 em pré-miRNAs de 60-70 nt. Os pré-miRNAs são então transportados para o citoplasma pela exportina-5 e lá processados ​​pela endonuclease Dicer para gerar um miRNA maduro de fita dupla de cerca de 21-23 nt. Após um processo de seleção/separação de fita, o miRNA maduro é incorporado ao complexo RISC enquanto a outra fita é degradada. O complexo RISC reconhecerá e mediará a clivagem ou repressão de mRNAs específicos.

Recentemente, foi hipotetizado um papel dos miRNAs na regulação positiva da tradução de proteínas. Um estudo recente [ 22 ] mostrou que o miR-369-3 ligou os elementos ricos em AU (AREs) do TNF α mRNA para regular a tradução, através do emparelhamento direto de bases entre a região “semente” do miR-369-3 e as regiões ARE complementares, sob condições de parada do ciclo celular. Os autores levantaram a hipótese de que os miRNAs podem alternar entre repressão ou ativação da tradução com base no status do ciclo celular: em células em proliferação, eles reprimem a tradução enquanto, sob parada do ciclo celular, promovem a tradução.

Outro estudo [ 23 ] indicou um possível papel dos miRNAs na ativação positiva da tradução. Os autores descobriram que o miR-10a interagiu com a região 5′ não traduzida (5′-UTR) dos mRNAs que codificam proteínas ribossômicas para melhorar sua tradução. Além disso, miR-10a resultou em ser capaz tanto de repressão de tradução através de ligação 3′-UTR ou de promoção de tradução via ligação 5′-UTR de diferentes alvos de mRNA. Esses dados sugerem que um mesmo miRNA pode exercer efeitos diferentes dependendo do local de interação com seus alvos.

3. Identificação de alvos de miRNA

A identificação de alvos de miRNA e de seus sítios de interação específicos é fundamental na compreensão do papel dos miRNAs na regulação de processos biológicos, bem como no desenvolvimento de malignidades humanas.

Alguns algoritmos, como miRanda ( http://www.microrna.org/microrna/home.do ), TargetScan ( http://www.targetscan.org/ ) ou PicTar ( http://pictar.mdc-berlin .de/ ), foram desenvolvidos para a predição computacional de alvos de miRNA. Todas essas previsões bioinformáticas são baseadas principalmente e limitadas em interações conservadas envolvendo a região “semente” de miRNA e os 3′-UTRs de mRNAs alvo. Uma limitação desses programas de previsão é que eles não são capazes de revelar novos aspectos do reconhecimento de alvos de miRNA. Previsões falso-positivas podem ser eliminadas por estudos de validação experimental, mas predições falso-negativas permanecem muitas vezes sem solução.

As abordagens experimentais para a identificação de alvos de miRNA se concentraram principalmente em análises de matrizes de expressão de transcriptoma e proteoma em células nas quais um único miRNA foi superexpresso ou inibido. Os efeitos nos níveis de proteínas alvo endógenos servem como um bom indicador para validar a interação miRNA-alvo. No entanto, essa abordagem sofre de uma limitação: de fato, quando um miRNA é introduzido, por transfecção, em altas concentrações em uma célula, isso pode afetar o efeito observado no mRNA alvo e gerar resultados falso-positivos, uma vez que o nível de repressão da tradução é fortemente dependente não apenas da complementaridade alvo de miRNA e mRNA, mas também da quantidade de mRNA alvo e da quantidade de miRNA disponível na célula [ 24 ].

Uma evidência direta de que um miRNA se liga a um mRNA alvo específico pode ser obtida por reticulação de formaldeído do miRNA aos seus alvos [ 22 ] ou por miRNAs modificados com 4-tiouridina [ 23 ], ambas as técnicas permitem o mapeamento subsequente do exato local de ligação usando a extensão do primer.

4. Desregulação de miRNA em tumores de tireóide

Os tumores da tireoide representam um bom modelo para estudar o desenvolvimento de câncer em várias etapas em células epiteliais, pois compreendem uma gama de lesões com diferentes graus de malignidade: de adenomas benignos diferenciados e não invasivos a carcinomas anaplásicos invasivos indiferenciados malignos. Os dois tumores de tireoide mais comuns são o carcinoma papilífero de tireoide (CPT) e o carcinoma folicular de tireoide (CFT), representando, respectivamente, cerca de 80% e 15% de todos os casos, ambos bem diferenciados e originários de células foliculares da tireoide. Os PTCs são frequentemente multifocais, caracterizados pela arquitetura papilar clássica, e geralmente metastatizam para os linfonodos regionais. Os FTCs geralmente são unifocais, encapsulados e geralmente metastatizam através do sistema vascular para pulmões e ossos. Ambos os tumores podem evoluir para carcinoma pouco diferenciado ou para carcinoma anaplásico completamente indiferenciado. Carcinomas anaplásicos de tireoide (ATCs) são cânceres de tireoide muito raros (2-5% de todos os casos), extremamente indiferenciados e altamente agressivos. O carcinoma medular da tireoide (CMT) é um tumor raro da tireoide, responsável por menos de 5% de todos os cânceres de tireoide, que se origina das células C intrafoliculares da tireoide.

Vários estudos independentes analisaram a expressão de miRNA em vários e diferentes tipos de tumores da tireoide, evidenciando uma desregulação de miRNA em tecidos cancerosos em comparação com seus equivalentes normais [ 25 – 38 ]; em tumores da tireoide, 32% de todos os miRNAs humanos conhecidos resultaram em regulação positiva e 38% em regulação negativa, com uma alteração de mais de 2 vezes em comparação com tecidos normais [ 39 ]. Além disso, o perfil de expressão de miRNA apresenta uma variabilidade significativa entre os diferentes tipos de câncer de tireoide, mesmo que sejam originários do mesmo tipo de células da tireoide [ 25 , 39]. O MTC derivado de células C tem um perfil de expressão de miRNA significativamente diferente dos tumores de tireoide originados de células foliculares; mas também carcinomas papilares, adenomas e carcinomas foliculares convencionais e adenomas e carcinomas foliculares oncocíticos, todos originários de células foliculares, apresentam perfis de expressão de miRNA diferentes e específicos. No momento, os papéis biológicos exatos dos miRNAs na carcinogênese da tireoide ainda precisam ser totalmente elucidados, mas parece razoável que o padrão distinto de expressão de miRNA em tumores da tireoide em comparação com o tecido normal da tireoide possa ser útil no diagnóstico e/ou terapia da neoplasia da tireoide e que diferentes padrões de expressão de miRNA em diferentes tipos de tumores de tireóide podem ser ferramentas úteis para sua classificação.

No entanto, a maioria dos estudos de perfil de miRNA não fornece uma estimativa da abundância de miRNA em tecidos normais da tireoide e em tumores da tireoide. Hoje, reconhece-se que apenas os miRNAs mais abundantemente expressos são capazes de ocupar uma fração substancial de seus alvos de mRNA, afetando sua tradução. A magnitude da repressão da tradução é fortemente dependente do número de complexos miRNA-RISC em relação à quantidade de moléculas de mRNA alvo. É hipotetizável que, entre todos os miRNAs desregulados, apenas aqueles que são abundantemente superexpressos ou fortemente desregulados estão envolvidos na tumorigênese da tireoide. Os miRNAs mais abundantemente expressos na glândula tireóide humana saudável estão listados na Tabela 1 ; os dados são derivados de http://www.mirz.unibas.ch/cloningprofiles/usando a ferramenta “visualização de perfis de expressão de miRNA”.

tabela 1 MiRNAs mais abundantemente expressos na glândula tireóide humana saudável 

. A tabela relata os miRNAs mais abundantemente expressos na glândula tireóide humana normal; os dados são derivados de 

http://www.mirz.unibas.ch/cloningprofiles/ . A ferramenta rastreou um total de 768 miRNAs humanos. Apenas miRNAs com um valor de abundância acima de 3,0 foram relatados na tabela.

 

5. O Papel dos MicroRNAs no Carcinoma Papilífero da Tireóide

Alguns estudos analisaram o perfil de expressão de miRNA em PTCs [ 26 – 32 ] (Tabela 2 ).

mesa 2 Estudos de desregulação do perfil de expressão de miRNA em tumores de tireóide. A tabela relata uma lista de estudos publicados sobre a desregulação do perfil de expressão de miRNA em diferentes tipos de tumores da tireoide. O tipo de amostras de tireoide analisadas, métodos de análise usados ​​e miRNAs regulados para cima ou para baixo individuados em tumores de tireoide estão descritos na tabela.

 

Comparando a expressão global de miRNA em PTCs humanos versus tecido tireoidiano não afetado He et al. [ 26] individuaram um conjunto de cinco miRNAs (miR-146, miR-221, miR-222, miR-21 e miR-181a) que foram significativamente superexpressos em PTCs em comparação com o tecido normal adjacente. Particularmente, três deles, miR-146, miR-221 e miR-222, mostraram níveis 11 a 19 vezes mais altos em tecidos tumorais. A sequência de sonda de miR-146 usada no chip de matriz de miRNA foi projetada para a isoforma miR-146a, localizada no cromossomo 5 humano. Recentemente, uma segunda isoforma, denominada miR-146b, foi descrita no cromossomo 10 humano. Esses dois miRNAs diferem apenas para dois nucleotídeos na sequência de suas formas maduras. Usando primers para formas prematuras de miR-146a e miR-146b, nenhuma expressão de miR-146a foi detectada em tecidos tireoidianos por análise de RT-PCR, enquanto uma superexpressão significativa de miR-146b foi encontrada em amostras de tumor PTC como confirmado também por Northern blot para miR-146b maduro. A desregulação de miR-146b, miR-221 e miR-222 na tireóide pode ser um componente crucial da iniciação e desenvolvimento do PTC. Suspeita-se que o alvo putativo desses miRNAs seja o KIT, um receptor de tirosina quinase que desempenha um papel importante no crescimento e diferenciação celular, atuando como um oncogene em muitos cânceres.41 , 42 ]. No entanto, a transformação neoplásica mostrou estar associada à superexpressão ou regulação negativa de c-KIT em diferentes tecidos [ 43 – 45]. Em tecidos PTC em que miR-146b, miR-221 e miR-222 foram fortemente superexpressos, houve uma regulação negativa do transcrito KIT e da proteína KIT. Em 50% dos casos, a expressão reduzida de KIT foi associada a alterações de um único nucleotídeo germinativo em ambos os dois sítios de reconhecimento de KIT para miR-221 e miR-222 (região 3′-UTR de KIT) e para miR-146b (exon 18 do KIT). Em conclusão, a regulação positiva desses cinco miRNAs específicos, e particularmente de miR-146b, miR-221 e miR-222, e a subsequente regulação negativa de KIT parecem estar envolvidas na patogênese do PTC, e alterações na sequência em genes alvo de miRNA podem contribuir à sua regulamentação.

O c-KIT é frequentemente expresso em adenomas benignos da tireoide e bócios, enquanto sua expressão resulta em redução em cerca de 60% dos FTCs e completamente ausente em PTCs e ATCs. Além disso, a ausência de expressão de c-KIT foi demonstrada também em metástases de tumores primários de tireoide, indicando que a modulação desse receptor de tirosina quinase não é dependente do microambiente tireoidiano, mas está associada ao fenótipo da célula maligna transformada [ 46 ]. Até o momento, o significado biológico da perda de c-KIT em tumores de tireóide não está elucidado. Surpreendentemente, a depleção da expressão de c-KIT em tumores de tireóide em contraste com o ganho de função de outros receptores de tirosina quinase como c-RET e c-MET ou de oncogenes como c-RAS, sugerindo que diferentes vias de sinalização do receptor de tirosina quinase podem exercer efeitos biológicos opostos em um determinado tipo de célula, controlando alternativamente a mitogênese ou a diferenciação celular. É hipotetizável que, no tecido tireoidiano, a via de sinalização c-KIT possa controlar alguns aspectos da diferenciação dos tireócitos, em vez da proliferação celular.

Pallante et ai. [ 27 ] analisaram o perfil de expressão global de miRNA em 30 PTCs humanos versus 10 tecidos normais da tireóide usando um chip de microarray contendo 368 precursores humanos e sondas de oligonucleotídeos de miRNA maduros, respondendo por 245 genes de miRNA humanos e de camundongo e incluindo todas as três isoformas humanas de miR-181 (miR-181a, miR-181b e miR-181c). A análise revelou um perfil de expressão de miRNA alterado que distinguiu PTCs de tecidos normais da tireoide: cinco miRNAs (miR-221, miR-222, miR-213, miR-220 e miR-181b) foram superexpressos nos tecidos neoplásicos. No entanto, um trabalho recente de Chiang et al. [ 47 ] sugeriram fortemente que o miR-220 não é um miRNA, e o miR-213 não é reconhecido como um miRNA no banco de dados de miRNA ( http://www.mirbase.org/). O estudo de Pallante et al. descobriram que miR-221, miR-222 e miR-181b resultaram em expressão abundante em PTCs, enquanto sua expressão era apenas fracamente detectável nos tecidos tireoidianos saudáveis, com a superexpressão de miR-221 atingindo um aumento de até 70 vezes. a superexpressão de miR-181b também foi confirmada por análise quantitativa de RT-PCR usando alguns primers projetados especificamente para o precursor da isoforma miR-181b para excluir um resultado falso-positivo para miR-181b, devido à possível hibridização cruzada de sondas para as isoformas miR-181a e miR-181c no chip de microarray. Os autores também demonstraram que miR-221 e miR-222 reduziram o nível de c-KIT em PTCs, confirmando dados publicados anteriormente [ 41]. Além disso, uma linhagem celular de carcinoma da tireoide humana transfectada com um vetor superexpressando miR-221 mostrou um aumento significativo do crescimento celular e, inversamente, a inibição da função de miR-221 por transfecção de oligonucleotídeo antisense na mesma linha celular resultou em um redução significativa do crescimento celular [ 27 ]. Os resultados desses estudos funcionais, juntamente com os dados de expressão relatados anteriormente, sugerem um papel crítico de miR-221 no crescimento de células de carcinoma de tireóide e, portanto, provavelmente no processo de carcinogênese papilar de tireóide.

Um estudo de Tetzlaff et al. [ 28 ] analisaram o perfil de expressão global de miRNA por chip de microarray (incluindo miRNAs conhecidos de humanos, camundongos, ratos e miRNAs humanos previstos/candidatos) em uma série de amostras PTC fixadas em formalina e incorporadas em parafina (FFPE) versus bócios multinodulares proliferativos benignos ( MNGs). A análise revelou um conjunto de 13 miRNAs regulados positivamente e um conjunto de 26 miRNAs regulados negativamente. A desregulação foi validada por RT-PCR em tempo real, em uma série independente de tecidos tumorais, apenas para miR-21, miR-31, miR-221 e miR-222, com miR-221 e miR-222 mostrando uma forte upregulation em PTCs em comparação com o conjunto independente de MNGs. Os dados deste estudo confirmaram que o miR-221 e o miR-222 estão alterados em PTCs, conforme descrito anteriormente em análises de tecidos frescos [ 26 , 27] e, principalmente, apoiou a possibilidade de usar tecidos tumorais FFPE para analisar a expressão de miRNA quando tecidos frescos não estão disponíveis ou para realizar estudos retrospectivos. O autor demonstrou a possibilidade de extrair miRNA suficiente de tecidos FFPE usando um método de rotulagem de miRNA para extratos de RNA total (All Total Nucleid Acid Isolation SyStem, Ambion) que contornava a necessidade de enriquecimento de miRNA e reduzia a quantidade de amostras iniciais, seguido por um amônio precipitação acetato/etanol.

Um estudo recente de Chen et al. [ 29] analisaram a expressão de um conjunto selecionado de miRNAs por RT-PCR quantitativo em PTCs, lesões não-PTC (adenoma folicular, nódulos hiperplásicos de carcinoma folicular) e tecido tireoidiano normal. Eles evidenciaram uma superexpressão de miR-146b, miR-221 e miR-222 em PTCs em comparação com o grupo não-PTC e controles saudáveis, mas com miR-221 e miR-222 apresentando uma sobreposição substancial entre diferentes grupos tumorais. Os autores concluíram que a análise da expressão de miR-221 e miR-222 não pode ser determinante na distinção de PTCs de outras lesões tumorais. Por outro lado, miR-146b resultou em ser consistente e especificamente superexpresso em PTCs clássicos, sugerindo este miRNA como uma possível ferramenta diagnóstica para identificar PTCs de outros tumores de tireoide. Alvos putativos de miR-146b são o fator nuclear- κ B ( NF-κB ), a quinase 1 associada ao receptor de interleucina-1 ( IRAK1 ) e o fator 6 associado ao receptor do fator de necrose tumoral ( TRAF6 ), cujo papel na carcinogênese da tireoide ainda não foi elucidado.

Mutações do gene BRAF estão implicadas na patogênese do PTC através da ativação constitutiva da via MAPK; os PTCs clássicos são frequentemente positivos para a mutação BRAF , enquanto os PTC foliculares são quase sempre negativos para a mutação BRAF [ 48 ]. Chen et ai. [ 29 ] encontraram também que a superexpressão de miR146b é comum tanto em variantes clássicas quanto foliculares de PTCs, independentemente pelo status da mutação BRAF , sugerindo essa superexpressão como um evento tardio na progressão de PTC e provavelmente importante para a definição de um fenótipo de carcinoma completo. Este resultado foi confirmado também por Sheu et al. [ 31 ] que analisaram, em uma série de 221 PTCs, se oBRAF V600Eestado mutacional foi correlacionado com o perfil de expressão de miRNA. Eles não encontraram diferença na expressão de cinco miRNAs (miR-146b, miR-181b, miR-21, miR-221 e miR-222) entre BRAF e PTCs de tipo selvagem. Além disso, este estudo confirmou a superexpressão de miR-146b, miR-221 e miR-222 como uma ferramenta útil para diagnóstico de PTCs.

Mais recentemente, Chou et al. [ 32 ] mediram a expressão de miR-146b, miR-221 e miR-222 em 100 casos de PTCs, constatando que seus níveis de expressão estavam associados à invasão extratireoidiana. Em particular, o miR-146b resultou em alta expressão em tumores com características de alto risco e com o BRAF V600E .

Os resultados de todos esses estudos concordaram com o fato de que o miR-221 e o miR-222 são superexpressos em PTCs em comparação com o tecido tireoidiano normal. A análise funcional da função do miR-221 em linhagens celulares derivadas de PTC humano indicou um papel direto deste miRNA na carcinogênese de PTC. Uma superexpressão de miR-221 induzida por vetor nestas linhagens de células resultou em um número maior de colônias de células em comparação com células transfectadas de controle negativo; inversamente, o bloqueio da função do miR-221 pelo oligonucleotídeo antisense causou uma redução significativa na proliferação celular [ 27 ]. Um estudo subsequente investigou quais vias ou alvos moleculares foram regulados por miR-221 e miR-222 [ 49 ]. Alguns programas de bioinformática sugeriram o CDKN1B ( p27 ^kip1), um importante regulador do ciclo celular que inibe o início da fase S, como alvo putativo de miR-221 e miR-222. Este estudo demonstrou que miR-221 e miR-222 regulam negativamente os níveis de proteína p27 ^kip1 em células Hela e células de carcinoma de tireóide por ligação a dois sítios-alvo específicos no 3′-UTR do gene p27 ^kip1 . A transfecção de TPC-1, linhagem de células de carcinoma papilífero de tireóide, com vetores para a superexpressão de miR-221 e miR-222 resultou em níveis diminuídos da proteína p27 ^kip1 . Por outro lado, a inibição da expressão de miR-221 e miR-222 por oligonucleotídeos antisense 2′-O-Me-221 e 2′-O-Me-222 específicos aumentou os ^kip1níveis de proteína p27. Em ambos os experimentos de transfecção não houve variação significativa de p27 ^kip1 mRNA. Os resultados deste estudo sugeriram fortemente que a superexpressão de miR-221 e miR-222 em células tumorais da tireóide pode ser responsável pela regulação negativa pós-transcricional da expressão da proteína p27 ^kip1 , induzindo as células a entrar na fase S do ciclo celular e, assim, aumentando crescimento celular.

As mutações do oncogene RET ocorrem em cerca de 43% dos PTCs [ 50 ], ativando constitutivamente o sinal MAPK e promovendo a carcinogênese. Essas mutações são responsáveis ​​pela desregulação da proliferação e diferenciação das células da tireoide e pela transformação tumoral da célula. Cahill et ai. [ 40 ] investigaram a expressão de miRNA em duas linhagens de células PTC humanas com um RETmutação, em comparação com linhas celulares normais da tireoide, descobrindo que 21 miRNAs foram significativamente superexpressos (miR-34a, miR-96, miR-99a, miR-100, miR-125b, miR-128b, miR-130b, miR-139, miR -141, miR-142-3p, miR-146, miR-148, miR-185, miR-200a, miR-200b, miR-211, miR-213, miR-216 e let-7d) e 14 miRNAs foram regulados negativamente (miR-15a, miR-34c, miR-107, miR-127, miR-135b, miR-145, miR-149, miR-154, miR-181a, miR-218, miR-299, miR-302b, miR -302c, miR-323 e miR-370) em linhagens de células tumorais quando comparadas à tireoide normal. Esses miRNAs diferencialmente expressos regulam potencialmente genes envolvidos nas funções da tireoide, e sua desregulação pode estar implicada na progressão do carcinoma de tireoide.

Um estudo funcional de Ricarte-Filho et al. [ 36 ] investigaram o envolvimento do miRNA let-7f, recentemente associado à redução do nível de proteína RAS em tumor de pulmão, no desenvolvimento de PTC. Os autores descobriram que, em linhagens celulares com mutação no RET da tireoide, a expressão aumentada do oncogene RET reduziu a expressão de let-7f. A transfecção estável de RETA linhagem celular TPC-1 mutada com vetor para a superexpressão de let-7f inibiu a ativação de MAPK e reduziu a proliferação celular. Em particular, let-7f aumenta a expressão de marcadores de diferenciação de células da tireoide, como o fator de transcrição TITF1, um fator chave no desenvolvimento normal da tireoide e, portanto, let-7f é fundamental para a regulação correta do crescimento e diferenciação das células da tireoide e a a expressão reduzida de let-7f em células da tireoide com mutação no RET é responsável pela desdiferenciação celular durante a progressão maligna do PTC. Curiosamente, let-7f, juntamente com a família miRNA let-7, é um dos miRNAs mais expressos na glândula tireóide saudável (Tabela 1), sugerindo ainda seu papel crucial no desenvolvimento e funcionalidade normal da tireoide. Todos esses dados sugeriram que o let-7f atuava como supressor tumoral e indicaram este miRNA como um potencial agente terapêutico em pacientes com PTCs portadores de mutação RET .

6. O Papel dos MicroRNAs no Carcinoma Folicular da Tireóide

Apenas dois estudos analisaram a alteração da expressão de miRNA em FTCs [ 25 , 33 ] (Tabela 2 ).

Em 2006 Weber et al. [ 33] investigaram se os miRNAs são expressos diferencialmente entre carcinomas foliculares de tireóide humanos (FTCs) e adenomas foliculares (FAs) testando duas matrizes de expressão de miRNA de alta densidade em 23 FTCs versus 20 amostras de FA e 4 controles de tireóide normais. Quatro miRNAs (miR-192, miR-197, miR-328 e miR-346) resultaram em superexpressos em FTCs em comparação com FAs. Nenhum desses miRNAs foi previamente associado a outras neoplasias da tireoide e parece ser específico para o fenótipo FTC. Dois deles, miR-197 e miR-346, foram validados também por RT-PCR quantitativo em tempo real que confirmou sua superexpressão significativa em carcinomas em comparação com adenomas e tecido saudável. Esses dois miRNAs podem participar da transformação de tumores foliculares de benignos para malignos, e eles e seus genes-alvo podem fornecer novos marcadores moleculares para diferenciar neoplasias foliculares malignas (FTCs) de benignas (FAs). Os efeitos desses dois miRNAs desregulados foram investigados funcionalmente usando duas linhagens de células de câncer de tireoide humano, FTC133 e K5, uma linha de células de câncer de tireoide papilar humano, NPA87, e uma linha de células de rim embrionário humano, HEK293T como controle. A indução da superexpressão de miR-197 e miR-346 induziu a proliferação celularin vitro , enquanto sua inibição levou à interrupção do crescimento celular em ambas as linhas celulares FTC133 e K5, mas não na linha celular NPA87, confirmando que a desregulação de miR-197 e miR-346 é um marcador do fenótipo FTC, mas não do fenótipo PTC. Análises in silico indicaram alvos putativos de miR-197 e miR-346 que foram validados também por análises funcionais in vitro . EFEMP2 (fibulina 4), uma proteína envolvida na estabilização e organização das estruturas da matriz extracelular que exerce funções supressoras de tumor [ 51 , 52 ], é inibida pela superexpressão do miR-346. Receptor de ativina A tipo 1 ( ACVR1), um potente inibidor do crescimento celular em vários tipos de células humanas, incluindo o epitélio da tireoide [ 53 ] e a tetraspanina 3 ( TSPAN3 ), cujo papel biológico exato em tumores ainda é desconhecido, são ambos subexpressos como consequência da superexpressão do miR-197. Além disso, os autores realizaram estudos funcionais também em miR-221 e miR-222 demonstrando que eles não têm um papel na tumorigênese do FTC.

More recently, Nikiforov et al. [25] compared miRNA expression profiles of principal types of thyroid cancers, finding a distinctive expression pattern associated to follicular thyroid tumors: miR-155, miR-187, miR-221, miR-222, and miR-224 resulted in being highly overexpressed in conventional FTCs, while miR-183, miR-187, miR-197, miR-221, miR-222, and miR-339 were overexpressed in the FTC oncocytic variants.

7. The Role of MicroRNAs in Anaplastic Thyroid Carcinoma

Few studies have analyzed the miRNA expression profiles in ATCs [34, 35, 37, 38] (Table 2).

Visone et al. [34] analyzed the miRNA expression of ATCs using a miRNA microarray chip, finding a significant down-expression of miR-26a, miR-30a-5p, miR-30d, and miR-125b in ATCs compared to normal thyroid samples. These data have been further validated by quantitative RT-PCR, Northern blot analyses, and in situ hybridization. Induced overexpression of miR-26a and miR-125b in two human ATC-derived cell lines resulted in cell growth inhibition, suggesting a role of these two miRNAs in negative cell cycle regulation and that their downregulation could be involved in thyroid tumorigenesis. No effect on cell proliferation was observed after induction of miR-30d and miR-30a-5p overexpression in the same ATC-derived cell lines. miR-26a influences cell cycle progression by negatively regulating the expression of EZH2 oncogene, an epigenetic gene silencer involved in neoplastic development. Recently, Sander et al. [54] suggested miR-26a acting as a potential tumor suppressor in MYC-induced tumors, since overexpression of miR-26a in murine lymphoma cell lines reduced cell proliferation by increasing the percentage of cells in G1 phase. miR-125b resulted in being deregulated in several human tumors, suggesting a role of miR-125b in human carcinogenesis [55–57]. An upregulation of miR-125b expression reduced the proliferation of the CD133-positive glioma cells and arrested the cell cycle at the G1/S transition level [58], through the downregulation of CDK6 and CDC25A, respectively, a cyclin-dependent kinase positively regulating the transition from the G0/G1 phase to the S phase of the cell cycle and a positive regulator of G1/S transition by dephosphorylation and activation of cyclin-CDK complexes. Both CDK6 and CDC25A have been previously reported to modulate the G1/S transition in human embryonic stem cells [59]. Recently, Liang et al. [60] demonstrated that miR-125b suppresses hepatocarcinoma cell proliferation both in vitro and in vivo and that this miRNA increases the expression of p21Cip1/Waf1, arresting cell cycle at the G1 phase.

Outro estudo [ 38 ] examinou a expressão de miRNAs em linhagens celulares derivadas de ATC versus linhas celulares derivadas de PTC, bem como amostras de tecido ATC versus amostras de tecido PTC, descobrindo que miR-21, miR-146b, miR-221 e miR- 222 foram superexpressos, enquanto miR-26a, miR-138, miR-219 e miR-345 foram regulados negativamente em linhas celulares e tecidos ATC. Além disso, como o miR-138 resultou em ser o único miRNA que mostrou um perfil de expressão diferente entre ATCs e outros tumores de tireoide derivados de células foliculares, os autores investigaram seu papel na tumorigênese de ATC, demonstrando que o miR-138 poderia direcionar diretamente a telomerase humana transcriptase reversa ( hTERT) no nível pós-transcricional. hTERT é uma subunidade catalítica da telomerase que resulta em superexpressão em ATCs primários em comparação com PTCs e associada à desdiferenciação celular e aumento do potencial metastático [ 61 ]. A regulação positiva de hTERT, subsequente à regulação negativa do miR-138, pode ser responsável pela progressão maligna de PTCs bem diferenciados em direção a ATCs indiferenciados. Uma vez que a regulação negativa do miR-138 parece estar fortemente associada ao fenótipo ATC, este miRNA pode ser útil como uma ferramenta de diagnóstico para o reconhecimento de ATC e pode contribuir para o desenvolvimento de uma nova estratégia de tratamento para ATCs.

Takakura et ai. [ 37] relataram um grupo de sete miRNAs (miR-17-3p, miR-17-5p, miR-18a, miR-19a, miR-19b, miR-20a e miR-92-1), denominados de forma compressiva como miR-17 -92 cluster, a ser superexpresso em linhagens de células ATC e lesões de câncer ATC em comparação com tecidos normais da tireoide adjacentes. Para investigar o papel funcional desses miRNAs desregulados na tumorigênese de ATC, linhagens de células ATC humanas foram induzidas a silenciar a expressão desses miRNAs por transfecção com antisenses específicos de miRNA. A inibição da expressão de miR-17-3p suprimiu totalmente o crescimento celular e induziu apoptose pela forte ativação das caspases 3 e 9. A supressão de miR17-5p ou miR-19a causou forte redução da proliferação celular, não associada à apoptose ou ativação de caspase. Além disso, a inibição de miR17-5p, mas não de miR-19a, também foi responsável pela senescência celular. alvo miR-17-5p e miR-19a,RB1 ) e homólogos de fosfatase e tensina ( PTEN ), confirmados pelo fato de que a expressão das proteínas RB1 e PTEN foi aumentada em células transfectadas com inibidores de miR-17-5p e miR-19a. Mutações do gene PTEN estão associadas à síndrome de Cowden caracterizada por tumores de mama e tireoide. O PTEN atua como um supressor tumoral, regulando negativamente o crescimento celular pela repressão da expressão do inibidor da quinase p27 ^kip1 dependente de ciclina . Uma expressão reduzida da proteína PTEN está associada ao desenvolvimento de câncer de tireoide [ 62 , 63 ], e a inativação de PTEN está associada a ATCs malignos indiferenciados, em vez de outros tipos de tumores de tireoide [ 64 ].]. Portanto, a superexpressão de miR-19a (e de sua isoforma miR-19b) pode ser responsável pela regulação negativa pós-transcricional de PTEN e subsequente aumento do crescimento celular em ATCs. Além disso, a regulação negativa da atividade supressora de tumor de RB1 pela superexpressão de miR-17-5p poderia contribuir ainda mais para o aumento da proliferação de células tumorais. Os inibidores seletivos de miR-17-3p, miR-17-5p e miR-19a demonstraram reduzir significativamente o crescimento celular em linhagens celulares derivadas de ATC, e o inibidor de miR-17-3p também induziu a morte celular. Portanto, esses inibidores podem representar abordagens terapêuticas válidas para o tratamento de ATCs.

Muito recentemente, Braun et al. [ 35 ] identificaram dois miRNAs, miR-30 e miR-200, que foram significativamente subexpressos em ATCs em comparação com PTCs e FTCs. a superexpressão desses dois miRNAs em linhagens mesenquimais derivadas de ATC reduziu seu potencial invasivo e metastático, regulando negativamente a expressão das proteínas de transição mesenquimal-epitelial (MET). Por outro lado, a inibição da expressão endógena de miR-200 foi suficiente para induzir o processo inverso, a transição epitelial-mesenquimal (EMT) responsável pela invasividade das células tumorais e potencial metastático. O miR-200 tem como alvo o ZEB1 e o ZEB2 , ambos repressores da expressão do gene E-caderina ( CDH1 ). Parque et ai. [ 65] demonstraram, em 60 linhagens de células humanas conservadas no Nation Cancer Institute, uma associação significativa entre a expressão de miR-200 e a razão E-caderina-vimentina. A superexpressão induzida de miR-200 causou a regulação positiva da E-caderina em linhagens de células tumorais e reduziu sua motilidade e invasividade. Por outro lado, a inibição de miR-200 reduziu a expressão de E-caderina, aumentou a expressão de vimentina e induziu EMT. Todos esses dados sugeriram o miR-200 como um fator chave do fenótipo epitelial em células cancerígenas que poderia ser usado como agente terapêutico para reduzir as taxas de carcinomas de tireoide invasivos e metastáticos.

8. O Papel dos MicroRNAs no Carcinoma Medular da Tireóide

Apenas um estudo [ 25 ] analisou a expressão de miRNA em CMTs em comparação com outros tumores de tireoide e tecido tireoidiano normal, encontrando um conjunto de 10 miRNAs específicos (miR-9, miR-10a, miR-124a, miR-127, miR-129 , miR-137, miR-154, miR-224, miR-323 e miR-370) regulados positivamente neste tipo de tumor. Ainda não foram realizados estudos funcionais.

9. Conclusão e Perspectivas Futuras

Os miRNAs são reguladores-chave poderosos da expressão gênica em muitos processos celulares fundamentais, como proliferação, diferenciação e apoptose. A desregulação da expressão de miRNA foi observada na iniciação, desenvolvimento e progressão maligna de numerosos tumores humanos [ 2 – 10]. Os perfis de expressão de miRNA resultaram em diferenças não apenas entre tumores e tecidos saudáveis, mas também entre diferentes lesões histopatológicas do mesmo tecido, entre tumores em diferentes estágios de malignidade e entre tumores primários e metástases. Portanto, perfis de expressão de miRNA podem se tornar novos biomarcadores úteis para diagnóstico de tumor e caracterização histológica. Descobertas recentes sugeriram que os perfis de expressão de miRNA podem permitir a classificação de tumores humanos mal caracterizados que não podem ser classificados com precisão apenas pelos padrões clássicos de expressão de mRNA [ 66 ]. Além disso, como as diferenças na expressão de miRNAs estão, em alguns casos, associadas ao prognóstico, a análise dos perfis de expressão de miRNAs poderia auxiliar também no manejo terapêutico dos pacientes.

Dados muito recentes apoiaram a possibilidade de usar miRNAs circulantes (plasma, soro, urina ou outros fluidos corporais) como uma nova classe de biomarcadores para diagnosticar tumores, pois os padrões de expressão de miRNAs circulantes são diferentes entre tecidos normais e cânceres e perfis peculiares de expressão de miRNAs estão especificamente associados a certos tipos de tumores [ 67 ]. Além disso, os miRNAs circulantes apresentam a vantagem de serem moléculas estáveis ​​com grande resistência à atividade da RNase que podem ser facilmente dosadas por técnicas não invasivas.

Além disso, uma vez que os miRNAs regulam a proliferação, diferenciação, apoptose e invasividade das células cancerígenas, os miRNAs e seus alvos biológicos podem ser alvos potenciais de estratégias genéticas terapêuticas em tumores humanos para interferir na iniciação e progressão do câncer. Os miRNAs são possíveis alvos para uma terapia baseada em RNA tanto pela modulação positiva da expressão de miRNAs específicos in vivo usando vetores de expressão [ 68 ] e/ou pela inibição da expressão de miRNA por transfecção de RNA antisense modificado com 2′-O-metil específico (antagomirs) [ 69 ].

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações irrestritas da Fondazione Ente Cassa di Risparmio di Firenze e Fondazione FIRMO Raffaella Becagli para ML Brandi.

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