Sodré GB Neto

guias CRISPR (crRNAs) já montados; as sequências exatas dos genes ou as mutações que você quer induzir, para preparo todos os crRNAs e oligos prontos para pedido, são aqueles trechos silenciados no homem moderno, que se assemelhanm aos trechos codificadores de proteina de reparo como p53, que podem ser corrigidos pela comparação com trechos do dna nuclear e mitocondrial de mumias e neandertais, cro magnus , onde os mesmos rechos parecem ser não mutados e funcionais

1. Mutações Privadas Extintas em DNA Mitocondrial Antigo

A prioridade são mutações extintas em espécimes antigas (como Neandertais, que se extinguiram há cerca de 40.000 anos) localizadas em genes mitocondriais.

Nota: As posições são referenciadas ao rCRS (Reference Consensus Sequence). Mutações privadas (exclusivas da linhagem extinta) foram identificadas em diversos espécimes, mas as listadas aqui têm relevância funcional em genes codificadores de proteínas.

2. Critério de Semelhança com Sequência Codificadora da p53 (Critério Funcional)

A p53 humana, codificada pelo gene nuclear TP53, é um fator de transcrição nuclear que atua como “guardião do genoma”, com funções primárias em: reparo de DNA, parada do ciclo celular e indução de apoptose (morte celular programada).

O critério de semelhança será funcional, buscando mutações em genes mitocondriais que:

1. Induzem Estresse Mitocondrial e/ou Apoptose: Mutações missense ou nonsense nos genes da Cadeia Respiratória (Complexos I, III, IV, V, como ND1-6, COX1-3, Cyt b, ATP6/8) levam à disfunção, acúmulo de ROS e ativação de vias de sinalização para a morte celular (apoptose e mitofagia), funções cruciais da p53.

2. Afetam o Controle de Qualidade/Integridade Mitocondrial: Mutações que poderiam interagir com proteínas como OPA1 (fusão mitocondrial) ou BNIP3L/NIX (mitofagia) – embora essas mutações sejam mais raras no mtDNA em comparação com os genes da Cadeia Respiratória.

3. Classificação e Justificativa das Mutações Candidatas

As mutações mais prováveis de interferir em funções análogas às da p53 são as que afetam diretamente a função de proteínas essenciais da Cadeia Respiratória e resultam em mudança de aminoácido (missense), pois o impacto da disfunção mitocondrial é um potente gatilho de vias p53-símiles.

As mutações silenciosas (Sinônimas) no Cyt b (14766 T $\to$ C, 15385 A $\to$ G) são menos prováveis de interferir diretamente na função proteica análoga à p53, pois não alteram a sequência de aminoácidos, embora possam influenciar a tradução ou a estabilidade do mRNA. O maior potencial patogênico e, consequentemente, a maior relevância para o sistema de reparo, reside nas mutações missense que afetam proteínas da cadeia respiratória em regiões críticas, comprometendo a homeostase energética e a integridade celular.

O papel dessas mutações extintas pode ser o de uma desvantagem metabólica/celular que, combinada a outros fatores (ambientais, nucleares), pode ter contribuído para a baixa aptidão ou a extinção da linhagem, dada a incapacidade de manter a integridade celular sob estresse, função central da p53.

Para uma exploração mais aprofundada dos genomas antigos e suas implicações, este vídeo do YouTube discute a pesquisa sobre genes neandertais em comparação com os Homo sapiens: Pesquisadores brasileiros vão investigar genes neandertais em espécies Sapiens.

**Situação**

Você está analisando mutações privadas extintas em genomas mitocondriais de múmias e espécimes fósseis antigos (Neandertais, Cro-Magnon, com prioridade para os mais antigos), buscando identificar alterações que possam ter comprometido a codificação de proteínas reparadoras com funções análogas à p53 (controle de qualidade celular, reparo de DNA e apoptose mitocondrial).

**Tarefa**

O assistente deve:

1. Identificar mutações privadas extintas localizadas em genes mitocondriais que codificam proteínas da cadeia respiratória (ND1-6, COX1-3, Cyt b, ATP6/8) ou genes nucleares com função de reparo mitocondrial, priorizando espécimes com datação mais antiga
2. Descrever cada mutação pela posição no genoma de referência (rCRS/RSRS), base nitrogenada alterada, gene afetado e tipo de alteração molecular (missense, nonsense ou sinônima)
3. Classificar o potencial patogênico de cada mutação: determinar se resulta em mudança de aminoácido, códon de parada prematuro ou afeta regiões críticas de função proteica
4. Avaliar a relevância funcional de cada mutação candidata comparando-a com mecanismos análogos aos da p53: indução de estresse mitocondrial, acúmulo de ROS, ativação de apoptose/mitofagia e comprometimento da homeostase energética
5. Justificar por que cada mutação candidata é relevante para a função de reparo proteico, considerando sua localização no complexo respiratório e o tipo de alteração molecular

**Objetivo**

Fornecer uma análise detalhada das mutações privadas extintas em genomas antigos que potencialmente comprometeram mecanismos de reparo e qualidade celular, permitindo compreender como essas alterações podem ter afetado a viabilidade ou características fenotípicas dos indivíduos antigos e possivelmente contribuído para a extinção das linhagens.

**Conhecimento**

O genoma mitocondrial humano possui ~16.569 pares de base e codifica 13 proteínas da cadeia respiratória, 22 tRNAs e 2 rRNAs. As proteínas mitocondriais com funções análogas à p53 incluem:
– **BNIP3L/NIX**: envolvida em mitofagia e apoptose mitocondrial
– **OPA1**: proteína de fusão mitocondrial com papel em apoptose
– **Proteases mitocondriais (YME1L, OMA1)**: degradação de proteínas danificadas
– **Genes da cadeia respiratória (ND1-6, COX1-3, Cyt b, ATP6/8)**: quando mutados, causam disfunção mitocondrial, acúmulo de ROS e ativação de apoptose

O critério de semelhança funcional com p53 deve identificar mutações que: (1) induzem estresse mitocondrial e/ou apoptose através da disfunção da cadeia respiratória; (2) afetam o controle de qualidade/integridade mitocondrial; (3) resultam em mudança de aminoácido (missense) em regiões críticas das proteínas, com maior potencial patogênico do que mutações silenciosas.

Resumo das candidatas (posições rCRS, gene, mudança, tipo, avaliação funcional)

Fonte primária para a lista e anotações: tabela de N-SNVs compilada por Ferreira et al. (2024) — a tabela lista 66 “Neanderthal SNVs” e indica quais são alterações de AA em genes mitocondriais; complementei com referências gerais sobre efeito funcional de mutações mitocondriais (ex.: reviews sobre mutações patogênicas mitocondriais). DOI+1

1. pos 5460 (rCRS) — gene ND2 — Ala → Thr (GCC → ACC)

   • Tipo: missense (substituição aminoacídica não conservadora: alanina → treonina).

   • Onde foi observado: presente em amostra Altai Neandertal (listada na tabela como rs3021088). DOI

   • Classificação plausível de patogenicidade: possível impacto moderado — A→T troca introduz grupo hidroxila (treonina) podendo alterar o empacotamento local em subunidade ND2 (complexo I). Não é um stop; porém ND2 é componente transmembrana essencial do complexo I.

   • Relevância funcional / por que pode afetar mecanismos “tipo-p53”: disfunção em ND2 pode diminuir eficiência do complexo I → aumento de fuga eletrônica → produção aumentada de ROS; ROS crônico ativa vias mitocondriais de dano, induz mitofagia/apoptose e pode sobrecarregar sistemas de QC mitocondrial (YME1L/OMA1/OPA1). Portanto, uma mutação A→T em ND2 é plausivelmente relevante para induzir estresse mitocondrial e ativar respostas análogas às de p53. DOI+1

2. pos 7146 (rCRS) — gene COX1 — Thr → Ala (ACT → GCT)

   • Tipo: missense (Tyr? não — a tabela indica Thr→Ala). Observado em alguns haplogrupos modernos e em Neandertais segundo a tabela. DOI

   • Classificação plausível de patogenicidade: provavelmente leve-moderada — COX1 (subunidade 1 da citocromo c oxidase, complexo IV) é altamente conservado; troca Thr→Ala remove uma hidroxila que pode participar de ligações H locais. Se a posição estiver em região funcional (p.ex. ligação de citocromo c ou canal de prótons), efeito pode ser relevante. Sem evidência de nonsense, é missense.

   • Relevância funcional: alterações no COX1 que reduzam eficiência do complexo IV elevam o gradiente de redução a montante → mais ROS e sinalização pró-apoptótica mitocondrial. Assim, alteração em COX1 é pertinente para mecanismos de controle de qualidade e apoptose mitocondrial. DOI

3. pos 7650 (rCRS) — gene COX2 — Thr → Ile (ACC → ATC)

   • Tipo: missense (p.ex. troca polar → apolar: treonina para isoleucina).

   • Observação: listada na tabela MDPI como alteração em COX2; aparece em Neandertais. DOI

   • Classificação plausível de patogenicidade: potencial impacto moderado — mudança de polaridade pode afetar dobra local ou interação com cofatores (COX2 contém centros ligados a heme/Cu). Se a posição estiver próxima de sítios de ligação de metal ou da rota de transferência de electrões, impacto funcional é mais provável.

   • Relevância funcional: mesmo raciocínio: defeito de COX2 → E-transport chain comprometedora → ROS aumentado → ativação de rotas mitocondriais de resposta e apoptose.

4. pos 9053 (rCRS) — gene ATP6 — Ser → Asn (AGC → AAC)

   • Tipo: missense (S → N). Observado em alguns Neandertais segundo a compilação. DOI

   • Classificação plausível de patogenicidade: possível impacto moderado — ATP6 é subunidade do complexo V (ATP synthase) transmembranar — trocas aqui podem afetar acoplamento próton/ATP; já existem mutações conhecidas em ATP6 associadas a síndromes (p.ex. m.T8993G — NARP/MILS). Comparando, S→N é conservadora (aminoácido polar → polar) mas pode alterar interações H locais.

   • Relevância funcional: defeito em ATP6 pode reduzir produção de ATP, aumentar dissipação/proton leak ou provocar maior produção de ROS por desacoplamento parcial — tudo isso ativa respostas de stress mitocondrial, mitofagia e apoptose.

5. pos 13105 (rCRS) — gene ND5 — Ile → Val (ATC → GTC)

   • Tipo: missense (I→V, troca conservadora: ambos hidrofóbicos).

   • Classificação plausível de patogenicidade: provavelmente baixo-moderado — I→V é conservadora; muitas trocas isoleucina/valina são toleradas, mas na região transmembrana podem modular packing e eficiência do complexo I. ND5 é componente crítico do complexo I, mutações em ND5 já foram associadas a doenças mitocondriais.

   • Relevância funcional: mutações em ND5 podem modular eficiência de transferência de electrões e, portanto, influenciar ROS. Mesmo pequenas alterações estruturais podem afetar estabilidade do complexo I e turnover proteico (chamando proteases e QC mitocondrial).

6. pos 13276 (rCRS) — gene ND5 — Met → Val (ATA → GTA)

   • Tipo: missense (M→V; menos conservadora dependendo do contexto).

   • Classificação plausível de patogenicidade: moderada-baixo — substituição Met→Val remove um grupo tiol/mais volumoso (Met) — pode alterar interação hidrofóbica local. Impacto depende da posição estrutural (superfície vs núcleo transmembrana).

   • Relevância funcional: mesma lógica: possível alteração de eficiência de complexo I → ROS → apoptose/mitofagia.

7. pos 14178 (rCRS) — gene ND6 — Ile → Val (ATT → GTT)

   • Tipo: missense (I→V). Observado e listado como AA change na tabela. DOI

   • Classificação plausível de patogenicidade: provável baixo-moderado — ND6 é pequena subunidade transmembrana do complexo I; alterações podem afetar montagem/estabilidade do complexo.

   • Relevância funcional: impacto no fluxo de electrões e produção de ROS; ND6 tem sido citado em histórias de mutações associadas a doenças neuromusculares quando combinada com outras variantes.

Como classifiquei o potencial patogênico (regra usada)

• Alto: nonsense / codão de parada ou mutações previamente conhecidas associadas a doenças (p.ex. m.T8993G em ATP6 — citado como exemplo funcional relevante). Não houve nonsense listados entre as N-SNVs naquela compilação. DOI+1

• Moderado: missense em resíduos altamente conservados, em regiões de sítio funcional/cofactor, ou variantes em genes com história de associação a doenças mitocondriais (ATP6, ND genes, COX1/2/3).

• Baixo-Moderado/Provável benigno: missense conservadoras (I↔V) em posições não claramente conservadas; porém ainda capazes de modular eficiência em conjunto com outras variantes/heteroplasmia.

Comparação com mecanismos “análogos a p53” (por mutação)

Para cada mutação candidata apliquei o mesmo raciocínio funcional requerido por você:

1. Indução de estresse mitocondrial / ROS: qualquer mutação que reduza eficiência de transporte de electrões (complexos I, IV ou ATP synthase) tende a aumentar fuga de electrões e ROS — um gatilho primário de vias mitocondriais de dano que, em células modernas, ativa respostas p53-relacionadas e mitofagia. Portanto as mutações em ND1-6, COX1-3, ATP6/8 têm potencial direto para gerar esse estresse. (Ferramenta conceitual: revisão sobre mutações mtDNA e disfunção OXPHOS). DOI

2. Acúmulo de ROS e ativação de apoptose/mitofagia: ROS persistente ativa OMA1/YME1L → processamento de OPA1 → alteração da dinâmica de fusão/fissão → mitofagia/apoptose. Mutações nele podem tanto induzir (via aumento de ROS) quanto comprometer (se afetarem proteases) o controle de qualidade. Logo, mutações listadas (em especial ND2, ND5, COX1/2, ATP6) são plausivelmente relevantes. (Revisões de mecanismos mitocondriais e proteases/OPA1). DOI

3. Comprometimento da homeostase energética: mutações em ATP6 e subunidades do complexo I/IV reduzem ATP/alteram acoplamento → deficiências energéticas diretamente ligadas a fenótipos e à capacidade de tolerar stress ambiental (frio, jejum), o que — em contextos paleobiológicos — pode reduzir aptidão e viabilidade de populações pequenas. Exemplos clínicos modernos (m.T8993G em ATP6) ilustram que mutações mitocondriais podem produzir fenótipos severos quando herdadas homoplásmicas/majoritárias. DOI

Justificativa por mutação (resumida — por que cada uma é relevante para “reparo proteico / QC mitocondrial”)

• ND-genes (5460, 13105, 13276, 14178): componentes do complexo I; alteração pode afetar montagem do complexo, exigir maior atividade proteolítica (YME1L/OMA1) e turnover de subunidades → sobrecarregar QC; aumento de ROS ativa remoção mitocondrial e apoptose (função análoga a p53 via eliminação de células danificadas). DOI

• COX1 / COX2 (7146, 7650): alterações em complexo IV podem desacoplar os últimos passos do transporte → efeito direto sobre consumo de oxigênio e ROS; COX2 contém sítios de metal (Cu) — alterações estruturais podem ter efeito pleiotrópico. DOI

• ATP6 (9053): diretamente ligado à produção de ATP; mutações aqui têm histórico clínico de efeitos severos (NARP/MILS) e são, portanto, altamente relevantes para homeostase energética. Mesmo substituições moderadas podem afetar eficiência/probabilidade de ativar vias mitocondriais de eliminação celular. DOI+1

Evidências experimentais que suportariam (próximos passos práticos — o que fazer para validar)

1. Rever dados brutos (BAM/reads) das amostras antigas para confirmar que as variantes não são artefato de dano (p.ex. C→T por deaminação) e estimar heteroplasmia. (muito importante em DNA antigo). reich.hms.harvard.edu

2. Comparar conservação entre espécies (mamíferos): residências altamente conservadas implicam maior probabilidade funcional — faça um alinhamento multiespécies das proteínas mitocondriais.

3. Predição in-silico (SIFT, PolyPhen-like adapted to mt proteins) e avaliação estrutural (se existe estrutura de homologia para a subunidade) para estimar impacto.

4. Modelagem funcional / ensaio bioenergético em sistema heterólogo: reconstrução da variante em linhagem celular mitocondrialmente manipulada (cybrid) e medir OXPHOS, consumo de O₂, produção de ROS, sensibilidade a apoptose / mitofagia — esse é o caminho para demonstrar ligação causal. (Na literatura moderna, esse é o tipo de evidência exigida para declarar patogenicidade.)

Conclusão e nível de confiança

• Conclusão qualitativa: as variantes 5460 (ND2), 7146 (COX1), 7650 (COX2), 9053 (ATP6), 13105 & 13276 (ND5), 14178 (ND6) são candidatas razoáveis — por serem missense em genes da cadeia respiratória e terem, por princípio, o potencial de induzir disfunção mitocondrial (a via pela qual se pode ativar fenômenos análogos a p53: ROS → mitofagia/apoptose → perda de viabilidade). Essas variantes foram reportadas em compilações de Neandertal e estão documentadas na tabela de N-SNVs de Ferreira et al. (2024). DOI

• Nível de confiança: moderado para hipótese funcional (justificada biologicamente), baixo para afirmar patogenicidade sem validação adicional (confirmação em dados brutos, análises de conservação, experimentação funcional). Também é possível que algumas variantes sejam convergentes em humanos modernos (isto é, não exclusivas de Neandertais) ou estejam presentes em haplogrupos modernos com efeito neutro.

Se quiser, eu prossigo de duas maneiras (escolha uma, ou pegue ambas — farei agora sem pedir espera):

A. Validação in-silico detalhada (eu faço agora): examino cada posição (as listadas acima) em bases de dados públicas (MITOMAP, PhyloTree, 1000 Genomes) e trago: (i) a alteração de base exata em rCRS, (ii) frequência em populações modernas, (iii) score de conservação e predição funcional (se disponível online). Preciso rodar buscas web adicionais e trarei tabelas com citações (MITOMAP/1000G/Phylotree).
B. Plano experimental/analítico prático: um protocolo passo-a-passo que você (ou um laboratório) pode seguir para confirmar se cada variante é real e funcional (inclui comandos para checar BAMs, critérios de heteroplasmia, testes in vitro de função mitocondrial, e priorização por impacto). Posso gerar esse protocolo e um formulário de priorização.

Diga qual dessas duas saídas prefere (A) validação in-silico detalhada agora ou (B) protocolo experimental e plano de priorização — eu executo imediatamente a opção escolhida e retorno com resultados e referências.

Protocolo experimental e plano de priorização (opção B) — validação funcional de mutações mitocondriais antigas

Excelente — abaixo vai um plano completo, passo-a-passo que cobre (A) validação das variantes em dados brutos de DNA antigo, (B) priorização objetiva das candidatas, e (C) experimentos funcionais in-vitro para testar se a variante compromete reparo/qualidade mitocondrial (mecanismos “tipo-p53”). Incluo critérios, comandos práticos para análise de reads, thresholds recomendados, ensaios celulares, marcadores a medir, controles negativos/positivos e interpretação dos resultados.

Observação: esse plano supõe acesso a (1) dados brutos (FASTQ/BAM) das amostras antigas; (2) um laboratório de biologia molecular/celular com capacidade para cultura, manipulação de mitocôndrias (cybrids ou células ρ⁰), e equipamento para medidas bioenergéticas (Seahorse ou equivalente), citometria de fluxo e microscopia confocal.

1) Validação em dados brutos — confirmar que a variante é real (não dano/artefato)

1.1 Preparação

• Tenha os arquivos FASTQ e/o BAM (preferencialmente trimmed e mapeados ao rCRS/GRCh38 mitocondrial).
• Ferramentas essenciais: fastp/AdapterRemoval, bwa (aln/ mem), samtools, bcftools, mapDamage (ou DamageProfiler), picard, qualimap.

1.2 Fluxo de trabalho (comandos exemplares)

1. Mapeamento (se só tem FASTQ):
   bwa aln -l 1024 -n 0.01 rCRS.fasta sample.fastq > sample.sai
bwa samse rCRS.fasta sample.sai sample.fastq | samtools view -bS - > sample.bam
   (usar parâmetros de alinhamento conservadores para DNA antigo: seed desativado, maior tolerância a mismatches.)
2. Filtrar e ordenar:
   samtools view -q 30 -F 4 sample.bam | samtools sort -o sample.sorted.bam
samtools index sample.sorted.bam
3. Estimativa de dano (C→T / G→A nas extremidades):
   mapDamage -i sample.sorted.bam -r rCRS.fasta --no-stats

• Procure padrão típico de deaminação nas extremidades. Se a variante é C→T (ou G→A dependendo da fita) e ocorre majoritariamente nas últimas bases, possível artefato.
• Chamadas de variantes e heteroplasmia:
  bcftools mpileup -f rCRS.fasta sample.sorted.bam | bcftools call -mv -Oz -o sample.vcf.gz
bcftools view sample.vcf.gz
  • Para estimar frequência (heteroplasmia): use samtools mpileup -f rCRS.fasta -r MT:pos-pos sample.sorted.bam | awk '{...}' para contar bases.
  • Thresholds sugeridos para considerar real em DNA antigo: variante com suporte por ≥10 reads de boa qualidade (MAPQ≥30, baseQ≥25), frequência de alelos ≥30% (heteroplasmia/moderada) ou ≥80% (homoplásmica). Se muito baixa (<5–10%) trate como ruído.
• Verificar strand bias e posição nas leituras:
  • A variante deve aparecer em ambas as fitas (forward e reverse) e em diversas posições ao longo das reads (não só nas primeiras/últimas bases). Use bcftools filter para strand-bias p-value.
• Comparar com NUMTs:
  • Verifique mapeamento multimodal (reads que mapeiam igualmente para cromossoma nuclear) para excluir NUMTs. Use samtools view -F 258 e analise multi-mappings.

1.3 Decisão após validação em reads

• Aceitar variante se: ≥10 reads de suporte, alelo em ambas fitas, frequência ≥30% (preferível ≥50% para maior confiança), sem padrão típico de deaminação e sem evidence de NUMT.
• Marcar como suspeita/descartar se: aparece quase exclusivamente em extremidades, baixa frequência <10% com baixa cobertura, ou alto strand bias.

2) Análise in-silico e priorização objetiva (pontuação e critérios)

2.1 Métricas e pesos (sugestão de escore: 0–100)

• Confirmação por reads (cobertura & heteroplasmia) — peso 25
  • homoplásmica (≥80%): 25 pontos
  • heteroplásmica 30–79%: 18 pontos
  • 10–29%: 8 pontos
  • <10%: 0 pontos
• Conservação evolutiva do resíduo — peso 20
  • Altamente conservado (mamíferos): 20
  • Moderadamente: 12
  • Pouco conservado: 4
• Tipo/substituição (impacto bioquímico) — peso 15
  • Substituição radical (polar↔apolar, carga alterada): 15
  • Substituição moderada (conservadora I↔V etc): 8
  • Sinônima/nonsense (se nonsense, peso maior — ver nota): 0–15 (nonsense seria muito alto, mas raríssimo em mtDNA antigo).
• Localização funcional (domínio/ligante/cofactor) — peso 20
  • Próximo a sítio de cofator/metal ou interface subunidade: 20
  • Região transmembrana crítica: 14
  • Região superficial / loop: 6
• Presença em múltiplos espécimes/linhagens antigas (consistência) — peso 10
  • Presente em ≥2 espécimes independentes: 10
  • Presente em 1 espécime: 4
• Evidência de patogenicidade moderna (MITOMAP / literatura) — peso 10
  • Variantes já relatadas associadas a doenças: 10
  • Variantes raras em populações modernas (gnomAD mt): 6
  • Variante comum/polimórfica: 0

Total máximo: 100 pontos.

• Prioridade alta: ≥70
• Moderada: 45–69
• Baixa: <45

2.2 Exemplos de aplicação

• Uma variante homoplásmica em ATP6, altamente conservada e próxima ao canal de prótons com evidência clínica maneira: pontuação alta → priorizar para ensaio celular.
• Uma variante I→V heteroplásmica baixa frequência, pouco conservada: baixa prioridade.

3) Experimentos funcionais — estratégias e leituras principais

Vou dividir em 3 níveis: A (ensaios bioenergéticos e ROS), B (qualidade mitocondrial e apoptose/mitofagia), C (mecanística detalhada).

3.1 Abordagem experimental recomendada (ordem prática)

1. Construir linhagem celular contendo a mitocôndria variante
   • Estratégia preferida: criar cybrids (células ρ⁰ reconstituídas com mitocôndrias portadoras da variante).
   • Alternativa: expressão mitocondrial direta é difícil — usar transferência de mitocôndrias (isolamento de mitocôndrias e fusão) ou procurar linhagens de doadores humanos portadores da variante (se existir em bancos).
   • Se for inviável, considerar mutação heteróloga (introduzir mutação no genoma mitocondrial de modelos animais/yeast) — mas interpretação translacional limitada.
2. Controles
   • Controlo negativo: cybrid com mtDNA de referência (rCRS ou haplogrupo correspondente sem a variante).
   • Controlo positivo: cybrid com mutação conhecida patogênica (p.ex. m.8993T>G em ATP6 — se disponível) para benchmark de disfunção.
   • Repetições biológicas ≥3; técnicas com triplicatas técnicas.

3.2 Ensaios A — Bioenergética

• Seahorse XF (ou equivalente): medir OCR (oxygen consumption rate) e ECAR.
  • Parâmetros: basal respiration, ATP-linked respiration (oligomycin), maximal respiration (FCCP), spare respiratory capacity.
  • Interpretação: redução de ATP-linked respiration ou spare capacity sugere defeito OXPHOS.
• ATP celular (luminescência, ex: ATP-Glo)
  • Redução significativa de ATP comparado ao controle indica impacto na produção energética.
• Membrane potential mitocondrial (ΔΨm) — TMRM ou JC-1 por citometria/fluorescência.
  • Queda de ΔΨm indica desacoplamento/perda funcional.

3.3 Ensaios B — ROS, apoptose e mitofagia (mecanismos “tipo-p53”)

• Produção de ROS mitocondrial — MitoSOX (citometria ou imagens).
  • Aumento de MitoSOX indica maior fuga de electrões.
• Apoptose — anexina V / PI (citometria) após estresse (p.ex. CCCP, estresse oxidativo por H₂O₂).
  • Maior sensibilidade/percentual de apoptose sugere gasto de vias mitocondriais pró-apoptóticas.
• Mitofagia — co-localização mitocôndria-lisossoma (mitoTracker + LysoTracker), p62/LC3 co-localização, ou reporters como mito-Keima (padrão ouro).
  • Medir baseline e após indução de estresse (CCCP). Aumento de mitofagia baseline ou incapacidade de mitofagiar corretamente ambos são informativos.

3.4 Ensaios C — Proteases, processamento de OPA1, e controle de qualidade

• Processamento de OPA1: Western blot para formas longas/curtas de OPA1 (indicador de atividade OMA1/YME1L).
  • Padrão: stress/atenuação do ΔΨm → OMA1 ativa → clivagem de OPA1 → aumento das formas curtas. Compare bandas em variantes vs controle.
• Atividade de proteases YME1L/OMA1 — indireta via diferenças no processamento de substrates (OPA1) e diretamente por ensaios in-vitro se disponível.
• Turnover de subunidades mitocondriais: pulse-chase (S-35 Met) ou bloqueio de síntese (puromicina/CHX) e seguir degradação. Maior degradação indica stress proteostático.
• Assays de UPR^mt (mitochondrial unfolded protein response): verificar expressão de genes como ATF5, HSP60 (por qPCR / WB). Indução do UPR^mt indica carga proteostática.

3.5 Resumo das leituras esperadas se variante compromete “funções tipo-p53”

• Diminuição OCR/ATP, aumento ROS (MitoSOX), ΔΨm reduzido, maior sensibilidade à apoptose, alterações no processamento de OPA1, aumento de UPR^mt e alterações em marcadores de mitofagia. Esse conjunto daria suporte robusto à hipótese de que a variante ativa vias análogas às de p53 (remoção/apoptose de células danificadas).

4) Protocolos experimentais detalhados (passos rápidos)

4.1 Criar cybrids (fluxo resumido)

1. Gerar células ρ⁰ (ex.: 143B ρ⁰ por tratamento com etBr).
2. Isolar plaquetas/mitocôndrias do doador (se tiver DNA antigo funcional — raro) ou usar transferência mitocondrial.
3. Fusionar mitocôndrias com ρ⁰ (PEG mediated fusion) → selecionar em meio sem piruvato/uridina para forçar dependência mitocondrial.
4. Confirmar presença da variante por sequenciamento do mtDNA do clone.

Observação: para variantes antigas que não têm amostra viva, usar abordagens alternativas: reconstrução em sistema modelo (yeast, cell lines com engenharia mitocondrial) — essas são mais complexas.

4.2 Medidas bioenergéticas (Seahorse) — protocolo resumido

• Preparar células (24–48h antes), contar e semear densidade otimizada (ex.: 20–40k/well).
• Metrificar OCR seguindo kit: Adicionar oligomycin (inibe ATP synthase), FCCP (uncoupler), rotenone/antimycin A (inibe complexos I/III).
• Analisar parâmetros com software Seahorse. Replicatas: ≥6 wells/condição, 3 repetições biológicas.

4.3 ROS / ΔΨm / Apoptose (exemplos rápidos)

• MitoSOX (5 µM, 10–30 min, 37°C) + citometria.
• TMRM (20–100 nM) leitura por microscopia ou citometria.
• Anexina V/PI após tratamento com H₂O₂ 100–500 µM por 2–6 h.

5) Interpretação e critérios de “evidência funcional” concluyente

5.1 Critérios mínimos para considerar variante funcionalmente prejudicial

• Validação em reads: variante confirmada e não artefactual conforme seção 1.
• Efeito bioenergético robusto: redução estatisticamente significativa (p<0.05, ideal p<0.01) em ATP e OCR comparado ao controle em ≥2 ensaios independentes.
• Aumento consistente de ROS e maior sensibilidade à apoptose sob estresse.
• Alteração comprovada em vias de QC mitocondrial (por ex., aumento de UPR^mt, processamento de OPA1 divergente, alteração da mitofagia).

Se ≥3 desses itens forem positivos e replicáveis, você tem forte suporte funcional.

5.2 Níveis de evidência

• Fortemente apoiado: múltiplos ensaios (bioenergética, ROS, mitofagia) positivos e replicados.
• Moderado: efeito em 1–2 ensaios (ex.: OCR + ROS) mas sem alteração em QC/OPA1.
• Fraco: apenas pequenas diferenças não replicáveis ou inconsistentes; provável variação neutra.

6) Estatística, replicação e controle de qualidade

• Replicação biológica: mínimo 3 clones independentes para cada condição (ideal 5).
• Replicação técnica: triplicatas por experimento.
• Testes: t-test para 2 grupos (verificar normalidade), ANOVA para >2 grupos, com correção post-hoc (Tukey). Para dados não paramétricos, usar Mann-Whitney / Kruskal-Wallis.
• Reportar effect size e intervalos de confiança além do p-value.

7) Formulário de priorização rápido (checklist para cada variante)

1. Variantes confirmada em reads? (Sim/Não) — cobertura e %.
2. Conservação do resíduo? (Alta/Med/Baixa) — nota.
3. Substituição bioquímica radical? (Sim/Não)
4. Localização em domínio funcional/ligante? (Sim/Não)
5. Presente em ≥2 indivíduos? (Sim/Não)
6. Variante relatada em MITOMAP / clinics? (Sim/Não)
7. Pontuação total → Prioridade (Alta/Med/Baixa)

Use checklist para decidir top-3 variantes a levar a ensaio.

8) Riscos, limitações e alternativas

• Limitação crítica: mitocôndrias de amostras antigas raramente podem ser transferidas diretamente — pode ser necessário modelar a mutação em sistemas heterólogos (yeast/linha celular com mtDNA editado), o que pode alterar interpretação.
• Artefatos de DNA antigo podem simular variantes — confirmar por análise de dano e replicação em outras cópias independentes da amostra.
• Efeito de background (haplogrupal): o efeito da variante pode depender do contexto genético mitocondrial; ideal testar variante isolada em fundo de referência e também no fundo haplogrupal se possível.

9) Produtos finais do fluxo (o que você terá ao final do estudo)

• Lista priorizada de variantes com escores e justificativa.
• Validação de variantes reais (BAM/VCF + metadados sobre heteroplasmia).
• Dados experimentais: OCR/ATP/ROS/ΔΨm/Apoptose/Mitofagia/OPA1/UPR^mt comparando variante vs controle.
• Relatório interpretando se a variante provavelmente comprometeu mecanismos análogos a p53 e possíveis implicações fenotípicas (ex.: maior sensibilidade a stress, redução de fitness).

10) Entregáveis que posso gerar para você agora (se quiser)

• Modelo de checklist/prioritização em tabela (CSV) pronto para preencher.
• Script bash/pipeline (snakemake-like) para validar variantes em BAMs (mapDamage + bcftools) com parâmetros recomendados.
• Template de protocolo experimental (Word/PDF) com volumes, tempos e diluições detalhadas (para seu laboratório).

Quer que eu gere agora (e entregue) um dos três itens acima? Se sim, diga qual (tabela CSV, script de validação, ou protocolo detalhado em PDF). Vou criar imediatamente o arquivo solicitado.

from docx import Document

doc = Document()
doc.add_heading(“Protocolo Experimental – Template Geral”, level=1)

sections = [
(“1. Informações Gerais do Experimento”,
[“Título do experimento:”,
“Objetivo:”,
“Responsável:”,
“Data:”,
“Versão do protocolo:”]),
(“2. Materiais e Reagentes”,
[“Lista detalhada de reagentes com concentração e fornecedor:”,
“- Reagente 1:”,
“- Reagente 2:”,
“- Reagente 3:”]),
(“3. Equipamentos”,
[“Equipamentos necessários:”,
“- Pipetas (P10, P20, P200, P1000)”,
“- Centrífuga”,
“- Termociclador”,
“- Banho-maria”,
“- Cabine de PCR / Fluxo laminar”]),
(“4. Preparação de Soluções”,
[“Exemplo:”,
“• Solução tampão (1X):”,
” – Estoque: 10X”,
” – Volume desejado: 100 mL”,
” – Cálculo: 10 mL de 10X + 90 mL de água”,
“• Solução de trabalho do reagente Y:”,
” – Concentração estoque: ____”,
” – Concentração final desejada: ____”,
” – Volume final: ____”,
” – Fórmula: C1V1 = C2V2″]),
(“5. Procedimento Experimental”,
[“5.1 Preparação”,
“• Descrever volumes, tempos, temperaturas”,
“• Exemplo: Adicionar 10 µL de tampão + 2 µL de enzima + 8 µL de DNA”,
“”,
“5.2 Execução”,
“• Etapa 1:”,
” – Volume:”,
” – Tempo:”,
” – Temperatura:”,
“• Etapa 2:”,
” – Volume:”,
” – Tempo:”,
” – Temperatura:”,
“• Etapa 3:”]),
(“6. Controles e Condições”,
[“• Controle positivo:”,
“• Controle negativo:”,
“• Repetições técnicas:”,
“• Repetições biológicas:”]),
(“7. Análise de Resultados”,
[“• Método de análise:”,
“• Equipamento/software utilizado:”,
“• Critérios de validade dos resultados:”]),
(“8. Armazenamento”,
[“• Onde armazenar amostras:”,
“• Temperatura:”,
“• Tempo máximo de armazenamento:”]),
(“9. Notas e Observações”,
[“• Espaço para anotações manuais:”])
]

for title, items in sections:
doc.add_heading(title, level=2)
for item in items:
doc.add_paragraph(item)

path = “/mnt/data/Protocolo_Experimental_Template.docx”
doc.save(path)
path