Padrões de expressão de microRNA para diferenciar adenocarcinoma pancreático de pâncreas normal e pancreatite crônica

[00:04, 02/07/2022] Sodré: https://www.clinicaltrials.gov/ct2/results?cond=pancreas+&term=dostarlimab&cntry=&state=&city=&dist=
resultados excelentes
O câncer de pâncreas tem algumas expressões de microRNA alterados

https://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/206899

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/ptr.5167

A curcumina modula o eixo miR-19/PTEN/AKT/p53 para suprimir a proliferação de células de câncer de
… Em células de câncer pancreático humano , a curcumina aumentou a regulação do miR-22 e a redução do miR oncogênico – 196 (Sun et al., 2008). A curcumina diminuiu miR-186 e miR-21 para promover…

Mark Bloomston, MD; Wendy L. Frankel, MD; Fábio Petrocca, MD; e outros Stefano Volinia, PhD; Hansjuerg Alder, PhD; John P. Hagan, PhD; Chang-Gong Liu, PhD; Darshna Bhatt, BS; Cristian Taccioli, BS; Carlos M. Croce, MD

Afiliações de autores Informações do artigo

JAMA. 2007;297(17):1901-1908. doi:10.1001/jama.297.17.1901

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Resumo

Contexto Embora os padrões globais de expressão de microRNA (miRNA) de muitos processos embrionários, fisiológicos e oncogênicos tenham sido descritos, falta descrição do papel dos miRNAs no adenocarcinoma ductal do pâncreas.

Objetivo Definir o padrão de expressão de miRNAs no câncer de pâncreas e compará-lo com os de pâncreas normal e pancreatite crônica.

Desenho e configuração As amostras foram obtidas em um centro abrangente de câncer designado pelo Instituto Nacional do Câncer de pacientes com adenocarcinoma ductal do pâncreas (n = 65) ou pancreatite crônica (n = 42) (janeiro de 2000 a dezembro de 2005). Todos os pacientes foram submetidos à pancreatectomia curativa; aqueles com câncer de pâncreas eram virgens de quimioterapia. O RNA colhido de cânceres pancreáticos ressecados e tecido pancreático adjacente benigno correspondente, bem como de espécimes de pancreatite crônica, foi hibridizado com microarrays de miRNA.

Principais medidas de resultado Identificação de miRNAs expressos diferencialmente que poderiam diferenciar câncer de pâncreas de pâncreas normal, pancreatite crônica ou ambos, bem como um padrão de expressão de miRNA preditivo de sobrevida a longo prazo (> 24 meses). Significância da Análise de Microarrays e Previsão de Análise de Microarrays foram realizados para identificar miRNAs preditivos de tipo de tecido e prognóstico. Os valores de p foram calculados pelo teste t , ajustados para testes múltiplos. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram construídas usando a expressão média de miRNA (alta vs baixa) como limiar e comparadas por análise de log-rank.

Resultados Foram identificados 21 miRNAs com expressão aumentada e 4 com expressão diminuída que diferenciaram corretamente o câncer pancreático de tecido pancreático benigno em 90% das amostras por validação cruzada. Quinze miRNAs superexpressos e 8 subexpressos diferenciaram câncer de pâncreas de pancreatite crônica com 93% de precisão. Um subgrupo de 6 miRNAs foi capaz de distinguir sobreviventes de longo prazo com doença com nódulo positivo daqueles que morreram em 24 meses. Finalmente, a alta expressão de miR-196a-2 foi encontrada para prever uma sobrevida ruim (mediana, 14,3 meses [intervalo de confiança de 95%, 12,4-16,2] vs 26,5 meses [intervalo de confiança de 95%, 23,4-29,6]; P = 0,009) .

Conclusões O câncer de pâncreas pode ter um padrão de expressão de miRNA distinto que pode diferenciá-lo do pâncreas normal e da pancreatite crônica. Os padrões de expressão de miRNA podem ser capazes de distinguir entre sobreviventes de longo e curto prazo, mas esses achados precisam ser validados em outras populações de estudo.

O câncer de pâncreas é uma doença letal, com mortalidade anual quase igualando a incidência de aproximadamente 33.000 nos Estados Unidos. ¹ Embora a migração de estágio seja parcialmente responsável pela baixa sobrevida, a biologia do adenocarcinoma ductal do pâncreas é de invasão local agressiva, metástase precoce e resistência à quimioterapia e radiação. Mutações genéticas conhecidas, incluindo TP53, KRAS, CDKN2A e SMAD4 , ² são importantes no câncer de pâncreas, mas individualmente não são responsáveis por seu comportamento agressivo.

MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes que são clivados de precursores de pré-miRNA em gancho de cabelo de 70 a 100 nucleotídeos no citoplasma por RNase III Dicer em sua forma madura de 19 a 25 nucleotídeos.³ Os miRNAs de fita simples ligam-se a RNAs mensageiros de potencialmente centenas de genes na região 3′ não traduzida com complementaridade perfeita ou quase perfeita, resultando em degradação ou inibição do RNA mensageiro alvo, respectivamente. Em humanos, a expressão aberrante de miRNAs contribui para a carcinogênese, promovendo a expressão de proto-oncogenes ou inibindo a expressão de genes supressores de tumor. ⁴ Tais “oncomirs” foram demonstrados em uma variedade de neoplasias hematológicas e sólidas. ⁵^– 7

Neste relatório, descrevemos uma série de experimentos projetados para identificar o padrão global de expressão de miRNA no adenocarcinoma pancreático para atingir vários objetivos. Primeiro, procuramos definir miRNAs que possam diferenciar o câncer de pâncreas de tecido pancreático benigno. Como o câncer de pâncreas geralmente ocorre em um contexto de pancreatite crônica, também usamos amostras de pancreatite crônica como um segundo controle. Em seguida, levantamos a hipótese de que um padrão separado de expressão de miRNA poderia distinguir pacientes com maior probabilidade de obter sobrevida de longo prazo daqueles com sobrevida mais curta. Finalmente, esperávamos identificar miRNA(s) com expressão preditiva de sobrevivência.MétodosAmostras de Tecidos

Depois que o status de isenção para o estudo foi concedido pelo conselho de revisão institucional da Ohio State University, amostras de 65 pacientes consecutivos que haviam sido submetidos à ressecção de adenocarcinoma ductal do pâncreas e 42 com pancreatite crônica de janeiro de 2000 a dezembro de 2005 foram identificados a partir do arquivo. arquivos do Departamento de Patologia da Ohio State University. Todos os casos foram revisados por um patologista (WLF) e os diagnósticos confirmados. Três núcleos de 2 mm foram obtidos dos blocos de parafina microdissecados para câncer de pâncreas e tecido pancreático adjacente benigno correspondente ou para pancreatite crônica. O pâncreas adjacente benigno estava disponível em todas as amostras de câncer pancreático.microarray miRNA

Os núcleos de tecido foram desparafinizados com xileno a 50°C por 3 minutos. A extração total de RNA foi realizada usando o kit RecoverAll (Ambion Inc, Austin, Tex) de acordo com as instruções do fabricante. A marcação de RNA e a hibridização em chips de microarray de miRNA foram realizadas conforme descrito anteriormente. ⁷Resumidamente, 5 μg de RNA total de cada amostra foi transcrita reversa usando o primer oligonucleotídeo de octâmero aleatório marcado com biotina. A hibridização de DNA complementar marcado com biotina foi realizada em um novo chip de microarray de miRNA personalizado da Ohio State University (OSU_CCC versão 3.0), que contém ≈1100 sondas de miRNA, incluindo 326 genes de miRNA humanos e 249 de camundongo, identificados em duplicatas. Os chips hibridizados foram lavados e processados para detectar transcritos contendo biotina pelo conjugado estreptavidina-Alexa647 e escaneados em um scanner de microarray Axon 4000B (Axon Instruments, Sunnyvale, Califórnia).Análise Estatística e Bioinformática

As imagens de microarray foram analisadas usando GENEPIX PRO 6.0 (Axon Instruments). Os valores médios dos pontos replicados de cada miRNA foram subtraídos de fundo, normalizados e analisados posteriormente. A normalização foi realizada usando o método de normalização mediana por chip e a matriz mediana. ⁸ Finalmente, selecionamos os miRNAs medidos como presentes em pelo menos tantas amostras quanto a menor classe no conjunto de dados (25%). As chamadas ausentes foram limitadas a 4,5 (log ₂escala) antes da análise estatística, representando o nível médio de intensidade mínima detectável no sistema. Mais de 95% das sondas em branco (ou seja, controles negativos) caem abaixo do valor limite de 4,5. miRNAs que são diferencialmente expressos entre câncer de pâncreas e pâncreas normal, câncer de pâncreas e pancreatite crônica e pancreatite crônica e pâncreas normal foram identificados usando o aplicativo Significance Analysis of Microarrays (SAM) versão 3.0 com uma diferença de limiar na expressão definida para 2, s0 percentil definido como 0,05 (padrão) e o número de permutações definido como 100 (padrão). ⁹O aplicativo SAM calcula uma pontuação para cada gene com base na mudança de expressão em relação ao desvio padrão de todas as medições. Apenas miRNAs maduros que são expressos diferencialmente são relatados. As assinaturas de miRNA foram determinadas pelo aplicativo Prediction Analysis of Microarrays (PAM) versão 2.1, que implementa os centróides encolhidos mais próximos. ¹⁰ O erro de predição foi calculado por meio de validação cruzada de 10 vezes. Para análise hierárquica, usamos o agrupamento de ligação média dos miRNAs identificados por SAM e PAM entre pâncreas normal e câncer de pâncreas (Cluster 3.0). Java Treeview 1.0 (Stanford University School of Medicine, Stanford, Califórnia) foi usado para visualização de árvores.

Para realizar a análise de sobrevivência e gerar curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier, os níveis de miRNA medidos nos chips de miRNA foram convertidos em variáveis discretas dividindo as amostras em 2 classes (alta e baixa expressão), usando o respectivo nível médio de expressão de miRNA como limite. As curvas de sobrevivência foram comparadas por análise log-rank. A significância foi aceita com 95% de confiança.Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real

O ensaio de miRNA TaqMan de tubo único (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) foi usado para detectar e quantificar miRNAs maduros em instrumentos de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real da Applied Biosystems de acordo com as instruções do fabricante. A normalização foi realizada com o RNA nuclear pequeno U6 (RNU6B; Applied Biosystems). Todas as reações em tempo real, incluindo controles sem modelo e controles negativos em tempo real, foram executadas em um termociclador GeneAmp PCR 9700 (Applied Biosystems). Os níveis de expressão gênica foram quantificados usando o ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). A PCR comparativa em tempo real foi realizada em triplicata, incluindo controles sem modelo. A expressão relativa foi calculada usando o método C _t comparativo .

Da mesma forma, o Ensaio de Expressão Gênica TaqMan foi realizado usando primers e sondas (pré-projetados, pré-otimizados) obtidos da Applied Biosystems para determinação da expressão de KRAS . Os ensaios usaram 150 ng de RNA por amostra, e 18S foi usado para normalizar todas as amostras.Northern Blots de miRNA

Para Northern blots de miRNA, 15 μg de RNA total foram separados em géis de poliacrilamida desnaturante a 15%, eletrotransferidos para membranas GeneScreen Plus (PerkinElmer, Waltham, Mass) e hibridizados usando tampão UltraHyb-Oligo (Ambion). Os oligonucleotídeos complementares ao miR-21 maduro foram marcados na extremidade com T4 Kinase (Invitrogen Corp, Carlsbad, Califórnia) e usados como sondas. A hibridização foi realizada a 42°C durante a noite e a membrana lavada duas vezes em 0,1x SSPE e 0,1% SDS a 42°C por 15 minutos cada. As membranas foram então expostas a uma tela de fósforo de armazenamento (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ) por 8 horas e fotografadas usando um Typhoon 9410 Variable Mode Imager (GE Healthcare Bio-Sciences). As imagens salvas foram cortadas usando o Photoshop 6.0 (Adobe Systems Inc, San Jose, Califórnia).Microarray de tecido

Nosso método para a criação de microarrays de tecidos foi descrito. ¹¹ Resumidamente, 2 núcleos de tecido (2 mm de diâmetro cada) foram perfurados de cada bloco de parafina usado para obter RNA para análise de miRNA e transferidos para cada um dos blocos de microarray de tecido receptor usando um instrumento de precisão (Beecher Instruments, Silver Spring, Md). O tecido embebido em parafina foi cortado a 4 mícrons e colocado em lâminas carregadas positivamente, depois aquecido a 40°C por 30 minutos. Depois de nivelar a parafina e os núcleos, a matriz foi resfriada a 4°C por 15 minutos.Imuno-histoquímica

Nossos métodos para análise imuno-histoquímica foram descritos. ¹¹ Anticorpos primários para TP53 (catálogo #M7001, clone DO-7; Dako, Carpinteria, Califórnia), CDKN2 (catálogo #CMC802, clone JC2; Cell Marque Corp, Rocklin, Califórnia) e SMAD4/DPC4 (catálogo #sc-7966 , clone B-8; Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, Califórnia) em diluições de 1:50, 1:20 e 1:100, respectivamente. As lâminas foram contracoradas em hematoxilina de Richard Allen, desidratadas através de soluções graduadas de etanol e cobertas com lamínula. Os controles positivo e negativo foram corados adequadamente.

A coloração para TP53 foi considerada positiva se a coloração nuclear em pelo menos 5% das células fosse observada. A coloração nuclear e citoplasmática em pelo menos 5% das células foi considerada positiva para CDKN2 e menos de 10% da coloração nuclear e citoplasmática das células para SMAD4/DPC4 foi considerada perda de expressão. Todas as colorações foram lidas por um patologista (WLF) cego para o estágio do tumor e características clínicas.Resultados

Usando microarray de miRNA, ⁸ miRNAs que foram expressos diferencialmente entre cânceres pancreáticos e tecido pancreático benigno adjacente correspondente, entre câncer pancreático e pancreatite crônica e entre pancreatite crônica e pâncreas normal. O aplicativo SAM identificou 30 miRNAs que foram regulados positivamente em cânceres pancreáticos e 3 que foram regulados negativamente em comparação com o tecido pancreático normal. Quando as amostras de câncer pancreático foram comparadas com aquelas de pancreatite crônica, 15 miRNAs foram superexpressos e 8 foram subexpressos em cânceres. Finalmente, 22 miRNAs apresentaram expressão aumentada na pancreatite crônica, em comparação com 2 que foram diminuídos em comparação com o pâncreas normal. tabela 1lista miRNAs expressos diferencialmente com pelo menos uma alteração de 2 vezes na expressão por SAM e miRNAs adicionais identificados como preditores de classe por PAM (veja abaixo). Um terço dos miRNAs encontrados para diferenciar o câncer pancreático do tecido pancreático normal também diferenciou os cânceres da pancreatite crônica ( Figura 1 ). Nenhum miRNA foi comum entre todos os 3 grupos de amostras.

A análise de agrupamento baseada em miRNAs expressos diferencialmente entre pancreatite crônica, pâncreas normal e câncer de pâncreas demonstrou uma distinção geral entre cada tipo de amostra (dados não mostrados). Os padrões de expressão parecem ser mais semelhantes entre pancreatite crônica e pâncreas normal, com uma distinção mais clara entre esses tecidos benignos e câncer de pâncreas. A maioria dos cânceres pancreáticos agrupados com algumas exceções, incluindo um grupo de 8 cânceres agrupados entre o pâncreas normal e amostras de pancreatite crônica. Este último grupo tinha características clínico-patológicas semelhantes às do restante dos cânceres, com sobrevida 50% maior, mas não estatisticamente significativa (mediana, 23,1 meses [intervalo de confiança de 95% {CI}, 19,6-26,6] vs 15,2 meses [95 % CI, 10,9-19,5]; P = 0,15). Este grupo de 8 tumores teve níveis significativamente mais baixos de expressão de miR-21 em comparação com os outros cânceres pancreáticos (mediana, 10,9 vs 8,3; P <0,001).

O aplicativo PAM permitiu a classificação de cada amostra por tipo de tecido com base nos níveis de expressão de miRNA ( Tabela 1). Um subconjunto de 21 miRNAs superexpressos e 4 subexpressos foi identificado que poderia discriminar corretamente o câncer de pâncreas do tecido pancreático normal por testes de validação cruzada em 90% das amostras. Quando a comparação foi feita entre pancreatite crônica e câncer de pâncreas, 93% das amostras foram classificadas corretamente com base em 15 miRNAs superexpressos e 8 subexpressos em câncer. A comparação entre pancreatite crônica e pâncreas normal identificou 15 miRNAs com expressão aumentada e 2 com expressão diminuída. Este padrão de expressão diferenciou corretamente a pancreatite crônica do pâncreas normal em todas as amostras. Finalmente, 95% das amostras de câncer de pâncreas foram classificadas corretamente quando comparadas com pancreatite crônica e pâncreas normal juntos.

Para confirmar os achados do microarray, a PCR quantitativa em tempo real foi realizada em 8 amostras de câncer pancreático e 8 controles de tecido pancreático benigno correspondentes para miR-21 , miR-221, miR-222, miR-181a, miR-181b, miR-181d, e miR-155 . Todos esses miRNAs foram superexpressos em amostras de tumor em relação ao tecido pancreático benigno ( Figura 2 ). A análise de Northern blot para miR-21 em 5 amostras frescas adicionais de câncer de pâncreas também confirmou expressão aumentada em comparação com 2 controles de tecidos benignos frescos incomparáveis ( Figura 3 ).

Para determinar o impacto da expressão de miRNA na sobrevivência, analisamos nossos dados de microarray usando 2 métodos. Primeiro, queríamos determinar se o nível absoluto de expressão de miRNA poderia discriminar entre sobreviventes de curto e longo prazo com doença com nódulo positivo. Dado que os pacientes com câncer de pâncreas metastático para linfonodos regionais que ainda estão vivos 2 anos após a ressecção são frequentemente considerados sobreviventes de longo prazo, comparamos os dados de microarray para pacientes com linfonodo positivo com sobrevida superior a 24 meses com dados para aqueles que morreram de doença em 24 meses. O aplicativo SAM identificou 6 miRNAs que foram superexpressos diferencialmente nos pacientes com maior sobrevida ( Tabela 2). Em seguida, queríamos determinar a sobrevivência com base na expressão relativa de miRNAs. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram geradas e comparadas por análise log-rank usando a variável binomial de alta ou baixa expressão em relação à expressão média de cada miRNA no microarray. Com base nisso, foram identificados 2 miRNAs de interesse: miR-196a-2 e miR-219 . Tumores com alta expressão de miR-196a-2 tiveram uma sobrevida mediana de 14,3 meses (95% CI, 12,4-16,2) em comparação com 26,5 meses (95% CI, 23,4-29,6) para aqueles com baixa expressão ( P = 0,009) . A alta expressão de miR-196a-2 , que foi observada em 75% dos tumores, resultou em uma sobrevida de 2 anos de 17% em comparação com 64% para baixa expressão ( Figura 4). A sobrevida média em pacientes com alta expressão de miR-219 foi de 13,6 meses (95% CI, 11,8-15,4), em comparação com 23,8 meses (95% CI, 18,7-28,9) para aqueles com baixa expressão, com sobrevida de 2 anos de 25 % e 49%, respectivamente ( P = 0,07). A sobrevida mediana para todos os pacientes foi de 15,5 meses (IC 95%, 9,9-21,1), com sobrevida de 2 e 5 anos de 33% e 12,5%, respectivamente. É importante notar que o estado nodal, o estágio T e o grau histológico não foram preditivos de sobrevida (dados não mostrados).

Em seguida, procuramos correlacionar a expressão de anormalidades genéticas comuns observadas no câncer de pâncreas com a sobrevivência e a expressão de miRNA. A expressão aumentada de TP53 foi observada em 31 (57%) de 54 tumores. A perda de expressão de CDKN2 foi observada em 49 (88%) de 56 dos tumores, enquanto a expressão de SMAD4/DPC4 foi perdida em 39 (70%) de 56. Nenhuma correlação foi encontrada com a sobrevivência ou com qualquer um dos miRNAs listados na Tabela 2 , incluindo miR-196a-2 . Além disso, a mutação KRAS foi identificada em 8 (80%) dos 10 tumores avaliados por análise de expressão gênica, mas não se correlacionou com a expressão de miRNA.Comente

Padrões aberrantes de expressão de miRNA foram descritos em uma variedade de neoplasias hematológicas e de órgãos sólidos. Identificamos – acreditamos pela primeira vez – um padrão de expressão global de miRNAs que pode diferenciar adenocarcinomas ductais do pâncreas de pâncreas normal e pancreatite crônica com 95% de precisão. Também identificamos um miRNA, miR-196a-2 , que pode impactar significativamente a sobrevida.

Para esta série de experimentos, escolhemos 2 controles para comparação: tecido pancreático benigno adjacente e pancreatite crônica. Embora nossas amostras de tumor tenham sido microdissecadas, a contaminação com alterações inflamatórias circundantes comuns em cânceres pancreáticos é inevitável. Ainda assim, apenas 7 miRNAs ( miR-99, miR-100, miR-100-1/2, miR-125a, miR-125b-1, miR-199a-1, miR-199a-2) que foram superexpressos em cânceres em comparação com o tecido pancreático normal também foram superexpressos na pancreatite crônica. Embora a superexpressão desses miRNAs em cânceres e pancreatite crônica possa sugerir um evento incitador comum para o crescimento neoplásico, a possibilidade de contaminação não pode ser excluída. Com poucas exceções, o pâncreas normal e a pancreatite crônica tendiam a se agrupar, permanecendo em grande parte separados dos cânceres pancreáticos. Curiosamente, 1 grupo de 8 cânceres se agrupou com as amostras benignas do pâncreas. Embora esse grupo de pacientes não tenha tido uma melhora significativa na sobrevida em comparação com os outros, sua sobrevida mediana de quase 2 anos é maior do que na maioria dos relatos de câncer de pâncreas. Destaca-se dentro deste grupo menor o cluster de miRs 23, 103 e 107, que foi menor nesses 8 cânceres do que nos demais cânceres ou na maioria das amostras benignas do pâncreas (dados não mostrados). Esses miRNAs, entre outros, recentemente demonstraram ser induzidos por hipóxia em células cancerígenas por meio de um mecanismo dependente de fator induzível por hipóxia.¹² De fato, a maioria dos miRNAs relacionados à hipóxia descritos são superexpressos diferencialmente nos cânceres pancreáticos em nosso estudo. Dada a associação entre o fator induzível por hipóxia e a agressividade do câncer de pâncreas, a diminuição da expressão desses miRNAs relacionados à hipóxia pode ser importante para a sobrevivência em um subconjunto de pacientes.

Vários miRNAs comumente associados à malignidade foram identificados como significativamente desregulados nos cânceres pancreáticos em nosso estudo. Mais notavelmente, miR-21 e miR-155 foram superexpressos exclusivamente em câncer de pâncreas versus pâncreas normal e pancreatite crônica. Foi sugerido que o MiR-21 desempenha um papel importante na prevenção da apoptose, funcionando assim como um proto-oncogene, ¹³ e demonstrou ser superexpresso em cânceres de pulmão, estômago, mama, cólon e próstata, além de ser expresso em tumores neuroendócrinos pancreáticos. ⁴^, 7 Enquanto o papel do miR-21na neoplasia não foi totalmente elucidada, sua inibição usando oligonucleotídeos antisense específicos de miRNA aumenta a suscetibilidade in vitro de células de colangiocarcinoma à gencitabina. ¹⁴ O miR-155 também é superexpresso em tumores sólidos, como os de cólon, pulmão e mama, ⁴^, 7 estando associado ao tipo de células B ativadas do linfoma difuso de grandes células B, bem como ao linfoma de Hodgkin e Burkitt. ¹⁵^, 16 Também demonstrou estar envolvido na leucemogênese em camundongos transgênicos. ¹⁷

O miRNA mais consistentemente expresso nos cânceres pancreáticos em nosso estudo foi o miR-221 quando comparado com pâncreas normal e pancreatite crônica. Embora essa associação não tenha sido demonstrada anteriormente em tumores do trato gastrointestinal, a expressão de miR-221 é importante no câncer de tireoide e sugere-se que desempenhe um papel na angiogênese. ¹⁸^, 19 Trabalhando em conjunto com o miR-222 , que também foi superexpresso nos cânceres pancreáticos que estudamos, o miR-221 tem como alvo o KIT, o receptor do fator de células-tronco.

Muito menos miRNAs foram regulados negativamente no câncer de pâncreas. Notável deles foi o miR-375 , que é encontrado em abundância nas ilhotas pancreáticas, mas não no pâncreas exócrino. ²⁰ É lógico que esse miRNA seria significativamente subexpresso em nossos cânceres pancreáticos porque todos eles eram derivados do pâncreas exócrino, resultando na obliteração das ilhotas intervenientes.

Nosso laboratório relatou recentemente os padrões de expressão de miRNA de 40 tumores endócrinos pancreáticos e 4 carcinomas acinares em comparação com pâncreas normal. ²¹ Nesse estudo, 87 miRNAs foram superexpressos diferencialmente em tumores e 8 foram subexpressos em relação ao pâncreas normal. Isso é marcadamente mais do que os 30 miRNAs superexpressos e 3 miRNAs subexpressos identificados em nossos adenocarcinomas pancreáticos de origem ductal. Dada a diferença na derivação de tumores endócrinos pancreáticos em comparação com adenocarcinomas ductais, essa ampla variedade na expressão de miRNA não é inesperada. Achados semelhantes foram relatados usando matrizes de genes Affymetrix. ²² Semelhante aos nossos achados em adenocarcinoma ductal, miR-21parece ser importante em tumores endócrinos pancreáticos. Nos tumores endócrinos, no entanto, o miR-21 correlacionou-se com tumores mais agressivos, evidenciado pelo aumento do índice de proliferação pelo Ki67 e pela presença de metástases hepáticas. Da mesma forma, a expressão de miR-21 foi significativamente menor nos 8 cânceres relatados neste documento que se agruparam com as amostras benignas de pâncreas, sugerindo seu papel na agressão do tumor. MiR-155 , por outro lado, foi subexpresso em tumores endócrinos pancreáticos em relação ao tecido pancreático benigno, enquanto encontramos superexpresso em adenocarcinomas ductais. Novamente, essa discrepância enfatiza as diferenças na origem celular entre os 2 tipos de tumor.

Dado o prognóstico sombrio tipicamente associado ao câncer de pâncreas, procuramos identificar um perfil de expressão de miRNA que pudesse discriminar entre pacientes de alto risco que poderiam ser considerados sobreviventes de longo prazo (ou seja, > 24 meses) e de curto prazo. Um grupo de 6 miRNAs foi identificado ( Tabela 2 ). O MiR-127 é interessante, pois está localizado dentro de uma ilha CpG no cromossomo 14 e demonstrou ser silenciado em cânceres de próstata e cólon. ²³ Nos cânceres pancreáticos em nosso estudo, a expressão de miR-127 estava aumentada em quase metade dos tumores, enquanto estava diminuída na outra metade. Claramente, miR-127a expressão por si só não afeta significativamente a sobrevida, mas, quando levada em consideração com os outros miRNAs listados na Tabela 2 , pode prever sobreviventes de longo prazo. Ainda menos se sabe sobre a expressão dos outros miRNAs listados no câncer, dificultando a especulação sobre seu papel no câncer de pâncreas neste momento.

Apenas 1 miRNA foi identificado que predisse significativamente a duração da sobrevivência, miR-196a-2 . Este miRNA não foi identificado pelo SAM para discriminar entre a distinção qualitativa de sobreviventes de longo e curto prazo. Isso não é surpreendente, no entanto, dados os diferentes métodos estatísticos usados para responder às duas perguntas diferentes. Embora uma associação direta com malignidade não tenha sido descrita para o miR-196 , ele parece interagir perfeitamente e degradar o HOXB8 , um membro da família homeobox envolvido em vários programas cruciais de desenvolvimento em animais, ²⁴ incluindo o pâncreas endócrino. ²⁵ Em nossos pacientes, 75% dos tumores expressaram miR-196a-2em um nível acima da média para o grupo. Embora esse miRNA não tenha ajudado a diferenciar câncer de pâncreas de pâncreas normal ou pancreatite crônica, seu potencial como preditor de sobrevida merece investigação adicional.

Finalmente, demonstramos que nossas amostras são representativas de adenocarcinomas ductais típicos, analisando as 4 anormalidades genéticas mais comuns observadas no câncer de pâncreas: TP53, CDKN2, SMAD4 e KRAS . As alterações nesses genes de interesse observadas nos tumores em nosso estudo foram semelhantes às descritas na literatura. ²⁶^– 28 Semelhante a relatos anteriores, esses genes supressores de tumor e oncogenes não se correlacionaram com a sobrevida em nossos pacientes, nem se correlacionaram com a expressão de miRNA.

O presente relato contribui para a crescente compreensão do papel dos miRNAs na oncogênese e descreve os padrões de expressão global de miRNAs no adenocarcinoma pancreático. Como nós e outros laboratórios continuamos a identificar os padrões de expressão de vários tumores sólidos, a aplicação desse conhecimento pode ser ampla. Esses padrões podem ser usados para direcionar a terapia em pacientes com tumores metastáticos de neoplasias primárias desconhecidas ou para ajudar a discriminar entre neoplasias benignas e malignas que de outra forma seriam indeterminadas por análises histológicas e imuno-histoquímicas de rotina. Mais importante, dados como o nosso, em que é possível começar a diferenciar entre pacientes com melhor ou pior prognóstico, podem ajudar a orientar o clínico na hora de determinar quem deve ou não receber terapia agressiva. Além desses exemplos diagnósticos e prognósticos de como os padrões de expressão de miRNA podem ser usados clinicamente, a capacidade dos miRNAs de afetar vários genes em várias vias os torna um alvo lógico para a investigação de novas terapias antitumorais. No entanto, esses dados preliminares precisarão primeiro ser validados em outros estudos.

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Autor correspondente: Mark Bloomston, MD, N924 Doan Hall, 410 W 10th Ave, Columbus, OH 43210 ( mark.bloomston@osumc.edu ).

Contribuições dos autores: O Dr. Bloomston teve acesso total a todos os dados do estudo e assume a responsabilidade pela integridade dos dados e pela precisão da análise dos dados.

Conceito e desenho do estudo : Bloomston, Croce.

Aquisição de dados : Bloomston, Frankel, Petrocca, Alder, Liu, Bhatt.

Análise e interpretação de dados : Bloomston, Petrocca, Volinia, Alder, Hagan, Bhatt, Taccioli, Croce.

Redação do manuscrito : Bloomston, Volinia.

Revisão crítica do manuscrito para conteúdo intelectual importante : Frankel, Petrocca, Alder, Hagan, Liu, Bhatt, Taccioli, Croce.

Análise estatística : Bloomston, Volinia, Hagan, Taccioli.

Apoio administrativo, técnico ou material : Croce.

Orientação do estudo : Frankel, Croce.

Divulgações Financeiras: Nenhuma relatada.

Financiamento/Apoio: Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) concede CA081534 e CA128609 (Dr Croce).

Papel do Patrocinador: O NIH não teve nenhum papel na concepção e condução do estudo; a coleta, análise e interpretação dos dados; ou a preparação, revisão ou aprovação do manuscrito.Referências

1.Jemal A, Siegel R, Ward E. et ai. Estatísticas do câncer, 2006.

CA Cancer J Clin . 2006;56:106-13016514137

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